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Dec 24, 2023

Un pipeline pour l'évaluation agnostique de la malignité et de la thérapie de la réponse aux médicaments anticancéreux à l'aide de mesures de la masse cellulaire

Volume Biologie des communications

Biologie des communications volume 5, Numéro d'article : 1295 (2022) Citer cet article

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Une correction de l'éditeur à cet article a été publiée le 06 janvier 2023

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La médecine de précision fonctionnelle offre un complément prometteur aux conseils thérapeutiques anticancéreux basés sur la génomique en testant l'efficacité des médicaments directement sur les cellules tumorales d'un patient. Ici, nous décrivons un flux de travail qui utilise des mesures de masse unicellulaire avec imagerie en ligne sur fond clair et classification d'images basée sur l'apprentissage automatique pour élargir l'utilité clinique de ces tests fonctionnels pour le cancer. À l'aide de ces mesures de masse organisées par image, nous caractérisons les signaux de réponse de masse pour 60 médicaments différents avec divers mécanismes d'action sur douze types de cellules différents, démontrant une capacité améliorée à détecter la réponse pour plusieurs médicaments à action lente par rapport aux tests de viabilité cellulaire standard. De plus, nous utilisons ce flux de travail pour évaluer les réponses aux médicaments pour divers formats d'échantillons de tumeurs primaires, y compris le sang, la moelle osseuse, les aspirations à l'aiguille fine (FNA) et les fluides malins, le tout avec des rapports générés dans les deux jours et avec des résultats cohérents avec les réponses cliniques des patients. La combinaison d'une mesure à haute résolution, d'une large applicabilité des médicaments et des tumeurs malignes et du retour rapide des résultats offerts par ce flux de travail suggère qu'il est bien adapté à la réalisation d'une évaluation fonctionnelle cliniquement pertinente de la réponse aux médicaments anticancéreux.

Des biomarqueurs efficaces pour l'oncologie de précision nécessitent des approches de mesure qui, en plus de prédire la réponse d'un patient au traitement, se prêtent à la collecte de données dans les limites des soins cliniques de routine contre le cancer. Les principales contraintes comprennent des quantités limitées d'échantillons de tumeurs pour la caractérisation, l'hétérogénéité biologique et l'exigence d'un retour rapide des résultats pour garantir l'actionnabilité clinique.

Les biomarqueurs génomiques sont devenus l'étalon-or pour guider le choix de la thérapie en oncologie de précision, démontrant un bénéfice clinique remarquable pour plusieurs altérations génomiques bien définies1,2,3. Cependant, des résultats cliniques récents ont montré que ces approches axées sur la génomique restent limitées dans leur portée. Plus particulièrement, l'étude NCI-MATCH (National Cancer Institute—Molecular Analysis for Therapy Choice) a révélé que moins de 20 % des patients étaient affectés à un traitement basé sur l'identification d'une mutation actionnable4. En tenant également compte des résultats pour les patients, des études récentes ont montré qu'environ 5 à 7 % des patients démontrent un bénéfice clinique des thérapies ciblées sur le génome5,6. De plus, les patients qui répondent initialement au traitement développent souvent une résistance, auquel cas l'analyse ultérieure des mutations exploitables offre rarement des informations supplémentaires pour guider la suite du traitement7. Ainsi, il existe un besoin critique de nouveaux outils qui complètent les approches génomiques pour permettre une sélection rationnelle de la thérapie pour une population plus large de patients atteints de cancer.

La médecine de précision fonctionnelle offre une telle approche8,9. Alors que les biomarqueurs moléculaires, histologiques et génomiques pour prédire la réponse aux médicaments contre le cancer reposent sur des mesures indirectes de la fonction cellulaire pour éclairer potentiellement la sélection des médicaments, la médecine de précision fonctionnelle mesure plutôt l'effet de médicaments spécifiques directement sur les cellules vivantes isolées de la tumeur d'un patient. Cette approche a l'avantage d'offrir un biomarqueur véritablement personnalisé pour l'efficacité potentielle des médicaments. Cependant, le besoin de cellules vivantes présente des défis distincts pour les tests, notamment la cellularité limitée offerte par les formats d'échantillons les plus accessibles sur le plan clinique, la perte de viabilité cellulaire et la dérive phénotypique rapide ex vivo. En raison de ces contraintes, de nombreux efforts de développement récents en médecine de précision fonctionnelle se sont concentrés sur les hémopathies malignes où l'accès à une abondance de cellules vivantes à partir d'un échantillon de tumeur frais est plus systématiquement faisable10,11,12,13,14,15. Cependant, une application plus large de ces approches aux tumeurs solides reste difficile, nécessitant souvent une culture prolongée pour développer les cellules ex vivo afin de permettre les tests de réponse aux médicaments16,17,18. Malgré des progrès récents encourageants pour tester plus rapidement des médicaments sur des cellules tumorales solides fraîchement isolées19, ces biomarqueurs doivent encore être traduits en flux de travail permettant des tests cliniques de routine.

Les principales exigences d'un test fonctionnel largement applicable pour la réponse aux médicaments anticancéreux comprennent (1) la flexibilité : le test doit être compatible avec divers formats d'échantillons de tumeurs qui sont collectés dans le cadre de soins cliniques standard et le biomarqueur doit démontrer une capacité à détecter une réponse aux médicaments de différentes classes. (2) Sensibilité et robustesse : le test doit être capable d'identifier des changements subtils dans les populations cellulaires à partir d'échantillons très hétérogènes. (3) Rapidité : la perte de viabilité cellulaire et la dérive phénotypique rapide ex vivo empêchent souvent les stratégies de dosage de médicaments à long terme en amont de l'évaluation de la réponse. De plus, pour guider efficacement la prise de décision thérapeutique, en particulier pour les patients atteints de maladies avancées ou en progression, les résultats des tests doivent être renvoyés dans un délai cliniquement exploitable.

Les mesures de masse unicellulaire sont particulièrement adaptées pour répondre aux exigences translationnelles des tests de médecine de précision fonctionnelle. En tant que lecture biophysique intégrative du phénotype, il a été démontré que la masse cellulaire change rapidement en réponse à un traitement avec des médicaments efficaces et, en tant que mesure unicellulaire, les populations peuvent être caractérisées à l'aide d'un nombre relativement faible de cellules20,21,22,23 ,24. De plus, il a été démontré que ces mesures du changement de masse cellulaire sont en corrélation avec la réponse au traitement du patient dans une gamme de tumeurs malignes23,24. Cependant, comme pour d'autres approches de mesure fonctionnelle, les défis logistiques et techniques liés à la réalisation de ces mesures de cellules vivantes continuent de limiter leur applicabilité clinique.

Nous décrivons ici un flux de travail de bout en bout qui étend l'espace d'application potentiel des tests de réponse aux médicaments basés sur la masse unicellulaire en démontrant la faisabilité de l'utilisation de cette approche pour évaluer l'efficacité des médicaments dans divers formats d'échantillons primaires provenant de tumeurs malignes hématologiques et solides. (Fig. 1). En utilisant des protocoles d'expédition et d'isolement de cellules tumorales spécifiques à divers formats d'échantillons, des suspensions unicellulaires viables sont générées (Méthodes). Après un traitement médicamenteux pendant la nuit in vitro, les distributions de masse de ces populations cellulaires sont mesurées à l'aide d'une plate-forme microfluidique qui intègre un résonateur à microcanal suspendu (SMR). Le capteur SMR permet des mesures très précises de la masse cellulaire dans une configuration de canal à écoulement simple, comme décrit en détail ailleurs25,26,27. En plus des mesures de masse, des images en fond clair sont collectées pour chaque particule traversant le capteur de masse, puis annotées à l'aide d'un classificateur d'images basé sur un réseau neuronal convolutif (CNN) pour garantir que seules les cellules d'intérêt uniques sont utilisées pour l'analyse statistique en aval. Ce flux de travail complet démontre une reproductibilité technique robuste (Fig. 1 supplémentaire) et est systématiquement réalisé en 2 jours.

Vue d'ensemble schématique de l'ensemble du pipeline de tests de dépistage de drogues, y compris la collecte et l'expédition d'échantillons, b l'isolement des cellules tumorales et l'incubation nocturne des médicaments, c la collecte de données de masse unicellulaire à l'aide de plus de douze instruments basés sur SMR avec imagerie en fond clair liée, la classification des images en aval, d statistiques analyse, appel de réponse électronique et rapport de résultats.

À l'aide de ce pipeline, une large gamme de thérapies peut être testée dans les 24 h suivant le traitement, comme démontré ici, avec des réponses de masse dose-dépendantes pour 60 médicaments différents avec des mécanismes d'action variables sur diverses lignées cellulaires. En outre, nous démontrons la faisabilité d'effectuer ces mesures pour plusieurs différents formats d'échantillons de tumeurs mini-invasives qui sont couramment collectés dans le cadre des soins cliniques de routine. Ceux-ci comprennent le sang, la moelle osseuse, les échantillons à faible apport tels que les aspirations à l'aiguille fine (FNA) et les fluides malins tels que les épanchements pleuraux. Ensemble, ces résultats démontrent qu'un test basé sur des mesures de masse unicellulaire annotées par image a le potentiel d'offrir une large utilité, est robuste à la complexité biologique des échantillons cliniques pertinents sur le plan de la traduction et peut être exécuté dans un délai cliniquement exploitable.

Pour capturer la réponse de la masse cellulaire au traitement avec une signification statistique adéquate, nous utilisons le format dynamique des SMR, permettant des mesures de masse de cellules individuelles23,24,25,26,27. Un capteur SMR est composé d'un porte-à-faux suspendu avec un canal microfluidique intégré en forme de U28 (Fig. 1c). Lorsqu'une cellule traverse le canal intégré, la masse du porte-à-faux est modifiée de manière transitoire, induisant un bref changement de la fréquence de résonance proportionnelle à la masse flottante de la cellule, appelée "masse" tout au long de cet article (Méthodes). Le schéma de contrôle fluidique mis en œuvre dans l'instrument (Fig. 2 supplémentaire), associé à la puce SMR, nous permet de mesurer de manière cohérente des échantillons de 5 000 cellules à partir d'un volume de 50 μl en 10 min.

Pour mesurer la réponse au traitement d'un échantillon de patient, nous isolons d'abord les cellules cancéreuses de l'échantillon (Fig. 2a) et incubons les cellules aliquotes avec des médicaments ou des combinaisons de médicaments (Méthodes). Nous faisons ensuite passer les populations de cellules à travers le capteur de masse pour capturer leurs fonctions de distribution de probabilité de masse cellulaire, que nous appellerons distributions de masse dans cet article. À titre d'exemple, la figure 2a montre trois distributions de masse distinctes - une distribution de référence de cellules traitées par le véhicule (gris) et deux distributions de cellules traitées par le médicament (bleu et violet). Nous comparons les distributions des cellules traitées à celles des cellules de référence en utilisant Earth Mover's Distance (EMD), une mesure de similarité statistique, et quantifions la différence en tant que signal de "réponse de masse" (Fig. 2b, Méthodes). Nous mesurons une réponse de masse plus grande pour des distributions de masse divergentes (valeur EMD plus élevée, bleu contre gris) et une réponse de masse plus petite lorsque les distributions de masse sont similaires (valeur EMD plus faible, violet contre gris). Pour obtenir une métrique indépendante de la malignité pouvant être utilisée dans divers types d'échantillons de tumeurs, nous normalisons chaque mesure de masse unicellulaire par la masse moyenne des cellules traitées par le véhicule dans l'échantillon, ce qui donne un signal de réponse de masse sans unité qui signale un changement de masse (en pourcentage) par rapport au témoin (Fig. 2b).

a Tout d'abord, les cellules cancéreuses isolées sont dosées et incubées avec des médicaments à tester (bleu et violet) ou un témoin traité avec un véhicule (gris). La masse des cellules individuelles de chaque population est mesurée par l'instrument SMR pour déterminer la distribution de masse des cellules traitées (courbes bleues et violettes) et des cellules de référence non traitées (courbe grise). b Les distributions de masse des cellules traitées et de référence sont comparées pour déterminer la réponse de masse au traitement. Le signal de réponse de masse est la distance statistique entre les deux distributions de masse calculée par la distance du moteur de terrassement (méthodes). La comparaison de deux distributions similaires (violet vs gris) donne un signal de réponse de masse plus petit, tandis que la comparaison de distributions divergentes (bleu vs gris) donne un signal de réponse de masse plus grand. c Représentation schématique montrant la structure du test de réponse de masse. Les cellules témoins traitées avec le véhicule sont mesurées à la fois avant et après les cellules qui sont traitées avec les médicaments testés. Cette approche permet de mesurer un signal de réponse de masse de base entre deux populations témoins (référence vs contrôle), qui capture les changements de masse possibles variant dans le temps en raison d'effets in vitro. d Diagramme de réponse de masse montrant les signaux de réponse de masse des cellules témoins et traitées illustrées en (a) et (b). Les intervalles de confiance à 95 %, représentés par des lignes superposées sur chaque point, sont calculés par bootstrapping à l'aide de données de masse unicellulaires (méthodes). Les valeurs p sont déterminées en comparant la différence d'amplitude de réponse de masse de TEST et CTRL à un seuil de "limite de décision" de 3 % (Méthodes). * indique p < 0,05, ns indique p > 0,05.

Comme avec d'autres tests statistiques basés sur la population, la précision de la mesure de la réponse de masse repose sur la façon dont les populations de cellules échantillonnées représentent la véritable distribution dans l'échantillon de tumeur. Pour comprendre l'impact des paramètres de mesure de masse tels que le bruit du capteur et le nombre de cellules mesurées, nous avons effectué des simulations à l'aide des données présentées à la Fig. 2a (Fig. 3a, b supplémentaires). Mesurer au moins 2500 cellules pour calculer une distribution de masse limite le bruit de base dans le signal de réponse de masse entre des échantillons identiques à moins de 1,5 % et l'écart type de la réponse de masse à moins de 1 %, alors que lorsque la mesure est basée sur un échantillon de 500 cellules, ces paramètres sont respectivement de 3 et 1 %.

En raison de l'hétérogénéité biologique inhérente des échantillons de patients, les cellules individuelles isolées dans un échantillon peuvent présenter différents niveaux de réponse au traitement. Par conséquent, la linéarité du signal est un attribut essentiel pour traduire avec précision le changement de masse induit par le traitement en une réponse de masse linéaire qui peut être comparée entre les échantillons, les médicaments et les doses de traitement. À titre de démonstration, nous simulons des amplitudes variables de réponses de masse en échantillonnant des cellules à différents rapports à partir des distributions traitées et de référence illustrées à la Fig. 2a. Nous montrons que le signal de réponse de masse est une fonction linéaire du rapport des cellules répondantes dans l'échantillon (Fig. 3c supplémentaire).

L'un des principaux objectifs des tests fonctionnels est de permettre d'effectuer des mesures dans des délais courts, idéalement inférieurs à 48 heures, en minimisant l'impact d'une éventuelle dérive phénotypique et d'un changement de viabilité des cellules cancéreuses primaires testées. Pour garantir des résultats de réponse au traitement précis et fiables, nous mesurons deux fois les cellules traitées par le véhicule, avant et après les populations de cellules traitées, pour tenir compte de toute dérive phénotypique au cours de la mesure de masse, qui peut prendre quelques heures lors du test de plusieurs conditions. Pour la plupart des médicaments présentés ici, le diméthylsulfoxyde (DMSO) est utilisé pour la dissolution et, par conséquent, le traitement au DMSO (0,25 %) seul sert de véhicule témoin. Les mesures de masse des cellules traitées avec 0, 25% de DMSO sont indiscernables des cellules non traitées, suggérant un effet minimal du DMSO seul sur la masse cellulaire (Fig. 1 supplémentaire). La figure 2c illustre la structure de l'approche de mesure. Tout d'abord, une population de cellules traitées avec le véhicule est mesurée pour être utilisée comme distribution "de référence". Ensuite, les cellules qui ont été exposées au traitement sont mesurées. Plusieurs "conditions" de traitement peuvent être mesurées séquentiellement après les cellules de référence pour tester un panel de médicaments. Enfin, une deuxième condition répliquée de cellules traitées avec le véhicule est mesurée en tant que "témoin". Pour quantifier les changements indépendants du traitement dans les cellules traitées par le véhicule tout au long de la durée de la mesure, nous calculons la réponse de masse entre les distributions de contrôle et de référence traitées par le véhicule (CTRL sur la figure 2d). Pour quantifier la réponse cellulaire au traitement, nous calculons la réponse de masse entre les cellules traitées avec le médicament et les cellules de référence traitées avec le véhicule (TEST sur la Fig. 2d). La comparaison des signaux TEST et CTRL à l'aide du bootstrap29 pour confirmer une différence d'amplitude de signal supérieure à un seuil de « limite de décision » donne une valeur p pour interpréter le résultat de la réponse au traitement (Méthodes). Par exemple, une distance mesurée entre les points bleus et gris de la Fig. 2d supérieure à la limite de décision avec une valeur p correspondante faible indiquerait que les cellules traitées avec le médicament testé ont changé leur masse par rapport aux cellules témoins à un niveau significatif. Une valeur de p élevée rejetant l'hypothèse indiquerait plutôt une absence de réponse au traitement (point violet sur la figure 2d). Dans cet article, nous définissons la limite de décision à trois sigma30 comme étant de 3 % pour toutes les mesures, ce qui correspond à trois fois l'écart type de la distance entre 500 cellules échantillonnées à plusieurs reprises dans une population de cellules (Fig. 3a supplémentaire).

Pour tester la robustesse de notre approche, nous avons simulé la dérive phénotypique cellulaire sous forme de perte de masse en fonction du temps (Fig. 3d supplémentaire). Nous avons testé différents taux de perte de masse par temps pour les cellules afin d'identifier les limites de la mesure pour capturer correctement la réponse des cellules traitées. En supposant un taux linéaire de dérive phénotypique en fonction du temps, nous constatons que pour résoudre correctement une amplitude de réponse de masse de 5 % (par rapport au contrôle), une dérive phénotypique des cellules traitées avec le véhicule doit être inférieure à 10 %. Nous n'avons pas observé de taux de dérive phénotypique dépassant ce nombre pour les lignées cellulaires ou les spécimens primaires rapportés ici. Néanmoins, notre approche nous permet d'identifier une dérive phénotypique significative en surveillant la distance entre les cellules de référence et de contrôle, comme le montre le signal CTRL (Fig. 2d). Si cette distance s'avère supérieure à 10%, nous concluons que le test n'est pas concluant en raison d'une forte dérive phénotypique.

Malgré la grande efficacité des kits d'enrichissement cellulaire disponibles dans le commerce (Méthodes), les échantillons de tumeurs primaires traitées contiennent souvent des débris biologiques et des agrégats cellulaires en plus des cellules individuelles d'intérêt. Étant donné que les mesures de masse ne peuvent à elles seules faire la distinction entre ces différents types de particules, ce matériau supplémentaire peut interférer avec la capacité de détecter les changements induits par les médicaments dans les distributions de masse. Pour relever ce défi, nous avons mis en œuvre une imagerie en fond clair en ligne avec le capteur de masse (Fig. 1) avec une détection de particules optiques en temps réel immédiatement en aval pour déclencher la capture d'image. Chaque mesure de masse est associée à son image en fond clair correspondante et annotée à l'aide de la classification d'image basée sur CNN. Cette classification d'images se déroule en deux étapes. Tout d'abord, un classificateur CNN binaire est utilisé pour identifier les événements unicellulaires à accepter et les événements non unicellulaires à rejeter, tels que les débris et les agrégats cellulaires. Chaque événement accepté est classé en tant que cellule unique intacte ou perméable et chaque événement rejeté est caractérisé comme un agrégat ou des débris à l'aide de deux classificateurs CNN binaires supplémentaires (Fig. 3a).

a Représentation schématique de l'approche de classification d'images en plusieurs étapes mise en œuvre dans le flux de travail illustré à la Fig. 1. Une image d'entrée est d'abord classée comme acceptée ou rejetée avec un classificateur CNN binaire, puis toutes les particules acceptées sont classées comme intactes ou la cellule perméable et toutes les particules rejetées sont classées comme agrégat ou débris avec deux classificateurs CNN binaires supplémentaires. Les images en médaillon sont représentatives de chaque classe. Les pourcentages entre parenthèses répertoriés à chaque nœud de décision binaire indiquent les performances du modèle à validation croisée, répertoriant respectivement les valeurs de précision et de rappel (Méthodes). b Graphiques en violon montrant les distributions de masse pour une population complète de cellules sans classification d'image (blanc) ainsi que des particules au sein de la population qui ont été classées comme agrégats (violet), cellules intactes (gris), cellules perméables (rose) ou débris (bleu ) pour un modèle de lignée cellulaire de cancer du poumon humain (PC9) et une lignée cellulaire de myélome multiple humain (MM1S). c La classification d'image unicellulaire réduit le bruit dans le signal de réponse de masse en réduisant l'erreur d'échantillonnage. À titre de démonstration, nous échantillonnons au hasard 1000 cellules 100 fois à partir d'une condition mesurée avec et sans curation d'image et calculons la réponse de masse moyenne dans ces deux ensembles représentant l'erreur d'échantillonnage avec et sans curation d'image. Lorsque cela est répété pour toutes les mesures présentées dans cet article, y compris 3222 conditions mesurées sur 13 instruments différents, nous constatons que la curation d'image réduit l'erreur d'échantillonnage de 16,2 % en moyenne. Un exemple de paire de distributions de masse avec (gris) et sans curation d'image (blanc) est montré, indiquant la présence d'agrégats cellulaires et de populations de débris dans l'ensemble de mesure d'origine, qui sont ensuite supprimés par le processus de curation d'image.

Nous avons formé les modèles CNN à l'aide d'images sélectionnées manuellement de chaque classe collectées pour une gamme de lignées cellulaires et d'échantillons de tumeurs primaires afin d'assurer la généralisabilité sur différents formats d'échantillons (méthodes). Lorsqu'ils sont appliqués à des ensembles d'images sélectionnés manuellement, ces modèles atteignent une précision et des valeurs de rappel validées croisées supérieures à 97 % pour chaque classe d'images (Fig. 3a).

Dans cet ensemble d'entraînement, les images avec de petites particules ou un matériau fibreux sont classées comme des débris, et les images avec des grappes de cellules clairement segmentées sont classées comme des agrégats. La discrimination des cellules intactes et perméables est basée principalement sur le contraste réduit observé dans les cellules qui ont vraisemblablement perdu leur intégrité membranaire. Cette perte de contraste observée par imagerie en fond clair est cohérente avec les données de viabilité collectées en parallèle avec l'évaluation par cytométrie en flux du DAPI, un colorant intercalant l'ADN qui est plus accessible aux noyaux des cellules non viables qui ont perdu une membrane cellulaire fonctionnelle (Fig. . 4).

L'utilité des mesures de masse unicellulaire annotées par image peut être constatée lors de la comparaison des distributions de masse de chaque classe de particules pour des lignées cellulaires présentant différentes caractéristiques de masse de base (Fig. 3b). Les cellules humaines du cancer du poumon (PC9) et les cellules humaines du myélome multiple (MM1S) ont des distributions de masse sous-jacentes significativement différentes. Compte tenu de cette variation, il ne serait pas possible de s'appuyer uniquement sur des mesures de masse pour identifier des cellules individuelles par rapport à des débris ou des événements agrégés basés sur un déclenchement universel dans différents types de cellules. En revanche, l'annotation et la classification des images offrent un moyen largement applicable d'identifier les particules d'intérêt dans divers échantillons, comme on peut le voir avec les tendances de masse constantes dans les classes de particules observées dans ces deux lignées cellulaires, les agrégats cellulaires ayant la plus grande masse suivie par intacte cellules, cellules perméables et débris. Cette flexibilité permet l'identification de cellules individuelles pour une analyse plus approfondie, quelle que soit la structure sous-jacente de la distribution de masse d'un spécimen donné. Cette capacité améliorée à caractériser les distributions de masse unicellulaire est une exigence clé pour identifier de manière robuste les réponses au traitement. Pour quantifier l'avantage de l'imagerie liée, nous avons comparé l'erreur d'échantillonnage entre des sous-ensembles aléatoires de cellules tirées de toutes les mesures de masse collectées dans une condition ou uniquement des mesures de masse annotées comme acceptées par la classification d'image (Fig. 3c). Sur 3222 ensembles de données différents collectés pour une gamme de cellules primaires et de lignées cellulaires, nous avons constaté que la conservation des images améliorait considérablement cette variabilité d'échantillonnage, avec une diminution moyenne de l'erreur d'échantillonnage de 16,2 % par rapport aux mesures non organisées de la même condition. Fait intéressant, les événements "Agrégats" semblaient représenter plus d'erreurs d'échantillonnage que les événements "Débris" lors de l'examen de chaque classe individuellement (Fig. 4b, c supplémentaires). Ces résultats démontrent la capacité de l'imagerie liée à améliorer la fiabilité de l'échantillonnage d'une distribution de masse sous-jacente, en particulier dans le contexte d'échantillons très hétérogènes où seul un sous-ensemble limité des mesures sont des cellules individuelles.

Lors de l'examen des modifications de la masse cellulaire pouvant survenir en réponse au traitement, nous définissons trois catégories potentielles liées au mécanisme d'action (MOA) d'un médicament : (1) modifications dues à l'arrêt du cycle cellulaire, (2) modifications dues à la perturbation des processus métaboliques , et (3) changements dus à une défaillance de l'intégrité structurelle de la cellule (Fig. 4a). En utilisant un ensemble d'hypothèses de base sur la nature de chaque type de mécanisme de réponse aux médicaments, nous pouvons créer des modèles simples qui démontrent les changements de masse attendus dans une population de cellules individuelles. Dans le cas de l'arrêt du cycle cellulaire, nous nous attendons à ce que la distribution de masse se consolide progressivement autour de la masse cellulaire moyenne du nouveau-né pour l'arrêt G0/G1 ou autour de la masse cellulaire moyenne avant la division pour l'arrêt G2/M (Fig. 4b). Des travaux antérieurs ont montré que la perturbation des voies métaboliques peut se manifester par des modifications de la masse unicellulaire31. Ces effets peuvent biaiser vers des processus anaboliques ou cataboliques, entraînant des cellules plus grandes ou plus petites, respectivement, comme le montre schématiquement la figure 4b. On s'attend à ce que la perturbation de l'intégrité structurelle des cellules entraîne les changements de masse les plus importants dans une population, car cette catégorie est compatible avec l'apoptose et/ou la nécrose des cellules, et la perte de masse est probablement due à des changements physiques dramatiques des cellules tels que la perte de intégrité membranaire/cytoplasme, bourgeonnement membranaire, fragmentation cellulaire et autres processus. Ici, nous supposons que de grandes quantités de perte de masse entraîneront le déplacement des cellules de leur distribution initiale traitée par le véhicule vers une distribution secondaire à chevauchement minimal (Fig. 4b).

Les thérapies avec différents mécanismes d'action (MOA) induisent différentes signatures de réponse de masse caractéristiques. Comme illustré dans (a), ces signatures MOA capturent les effets des médicaments qui peuvent être grossièrement classés en trois catégories générales, y compris l'arrêt du cycle cellulaire, la perturbation métabolique ou la perte d'intégrité structurelle. b Démonstrations schématiques des changements dans les distributions de masse entre une population témoin (remplissage gris, ligne pointillée) et une population traitée avec un médicament (remplissage rouge, ligne continue) causés par l'arrêt G1, l'arrêt G2, le biais catabolique, le biais anabolique ou la membrane cellulaire perte. c Exemple de changements expérimentaux de distribution de masse en réponse à un traitement médicamenteux correspondant à chaque résultat schématique présenté directement ci-dessus en (b). d Mesures de réponse de masse recueillies avec trois instruments différents (points individuels avec des barres d'erreur correspondant à l'intervalle de confiance à 95 % de l'EMD pour chaque système défini par 5 000 échantillons aléatoires de 2 500 cellules), correspondant aux données expérimentales présentées directement ci-dessus en (c).

Les médicaments avec les modes d'action décrits ici sont raisonnablement courants, tout comme les lignées cellulaires homogènes qui répondent à ces médicaments, ce qui nous permet de tester ces modèles hypothétiques. Pour tester le résultat de la réponse de masse de l'arrêt G0 / G1, nous avons exposé la lignée cellulaire H1666 du cancer du poumon humain à 10 uM de trametinib, un inhibiteur de MEK, pendant 17 h, ce qui arrête la plupart des cellules au début de G1 (Fig. 5a supplémentaire)32. Conformément aux attentes, nous avons vu la distribution de la masse cellulaire se déplacer vers le bas par rapport au témoin (Fig. 4c, d). En revanche, en traitant les cellules MDA-MB-361 pendant 24 h avec du docétaxel 10 nM, un inhibiteur des microtubules qui empêche la division cellulaire, nous observons une augmentation significative de la masse (Fig. 4c, d et Supplémentaire Fig. 5b). Ces deux phénotypes d'arrêt du cycle cellulaire sont au cœur de l'activité de nombreux médicaments, à la fois des inhibiteurs ciblés et des chimiothérapies, et la réponse de masse résout ces phénotypes de manière robuste dans de nombreux exemples (Fig. 6 supplémentaire). Pour produire des données sur le biais métabolique, nous avons traité des cellules avec du cycloheximide, un inhibiteur ribosomique, ou du carfilzomib, un inhibiteur du protéasome, pour orienter le métabolisme vers le catabolisme ou l'anabolisme, respectivement. Dans les cellules L1210 traitées avec 400 nM de cycloheximide pendant 24 h, nous observons une diminution de la masse cellulaire moyenne dans la population, compatible avec l'inhibition de la biogenèse des protéines33. Si nous regardons les cellules U266 traitées avec 50 nM de l'inhibiteur de protéasome Carfilzomib pendant 6 h, nous observons plutôt une augmentation subtile de la masse moyenne des cellules, compatible avec une accumulation excessive de protéines avant la cytotoxicité en aval (Fig. 4c, d)34. Enfin, à titre d'exemple de perturbation structurelle complète, nous avons utilisé des cellules L1210 traitées avec un détergent Tween 20 à 0,5 % pendant 10 min, ce qui perméabilise la membrane cellulaire et enrichi à 40 % d'une population cellulaire autrement saine. Ici, nous observons une diminution du pic de masse primaire représentant les cellules vivantes et une augmentation du plus petit pic, qui représente les cellules perméabilisées (Fig. 4c, d). Ces mêmes modifications des distributions de masse peuvent être observées pour les cellules après la mort cellulaire induite par des médicaments cliniquement pertinents (Fig. 7 supplémentaire).

La capacité des distributions de masse à discerner ces différents profils de réponse le rend bien adapté à la détection de la réponse aux médicaments dans des échantillons primaires hétérogènes. La nature dynamique de ces mécanismes de changement de masse, combinée à l'hétérogénéité du moment de la réponse cellulaire et de la dérive phénotypique potentielle ex vivo, signifie que la présentation de ces mécanismes n'est pas nécessairement uniforme dans une population de cellules. Par exemple, même dans des lignées cellulaires homogènes, telles que les cellules PC9 traitées avec de la doxorubicine, différentes doses du médicament à un moment donné montrent comment le signal de réponse de masse peut se manifester à la fois par l'arrêt du cycle cellulaire et la perturbation structurelle, seuls ou simultanément (Fig. . 8).

En plus de la compatibilité avec divers mécanismes médicamenteux, lorsque l'on considère le rôle de la mesure de la réponse de masse dans un pipeline clinique, il est également important de démontrer la compatibilité avec des échantillons de cellules tumorales hétérogènes qui ont une fenêtre temporelle limitée de stabilité phénotypique ex vivo pendant laquelle la sensibilité aux médicaments peut être évalué. Il est donc important d'évaluer les effets de la concentration de médicament et du temps, ainsi que l'hétérogénéité de réponse sous-jacente sur les lectures de réponse de masse.

L'approche canonique utilisée pour caractériser la sensibilité aux médicaments en fonction de la dose et du temps est la courbe dose-réponse basée sur la viabilité ou courbe IC50. En tant que tel, une gamme de marqueurs de viabilité et de techniques (c'est-à-dire MTT, ATP, cytométrie en flux) ont montré un potentiel en tant que biomarqueurs fonctionnels pour les soins contre le cancer, mais l'impact de ces approches dans le contexte d'échantillons de tumeurs primaires a souvent été limité par le nombre de cellules nécessaires et le temps nécessaire pour effectuer ces tests1. Cependant, en tant que norme établie, les courbes IC50 fournissent un comparateur et un modèle utiles pour comprendre les variables qui affectent la réponse cellulaire aux médicaments. Les mesures d'IC50 balayent l'espace de dose pour définir le point d'inflexion de dose au-dessus duquel une majorité de cellules meurent en réponse à un médicament. Le moment optimal pour évaluer la réponse à la dose basée sur la viabilité est généralement dicté par le mécanisme du médicament et la lignée cellulaire étudiée. Pour les médicaments à action rapide, un point de temps de 24 h est souvent suffisant pour définir avec précision la sensibilité cellulaire ; cependant, pour les médicaments à action lente (p. ex., les médicaments fonctionnant par arrêt du cycle cellulaire), un délai de 72 h ou plus peut être nécessaire.

Pour évaluer comment ces paramètres de concentration et de synchronisation de la dose affectent la réponse de la masse cellulaire, nous avons modulé ces variables indépendamment dans les lignées cellulaires pour comprendre leur effet. Les cellules MM1S traitées avec une gamme de concentrations de carfilzomib pendant une durée fixe (15 h) ont montré une réponse de masse dose-dépendante similaire aux courbes IC50 collectées pour la même lignée cellulaire (Fig. 5a). Nous avons également noté que la réponse de masse change avec le temps en réponse à une concentration fixe de médicament (Fig. 5b). Pour les médicaments à action rapide, qui induisent rapidement une cytotoxicité, l'ampleur de la réponse de masse démontre une dépendance à la dose conforme aux mesures de perte de viabilité recueillies à des moments similaires (Fig. 5c et Supplémentaire Fig. 9a, b). Cependant, grâce à la capacité de détecter des signaux avant la mort cellulaire, la réponse de masse peut détecter les effets des médicaments à action lente bien avant une perte de viabilité de 50 % nécessaire pour définir un signal IC50 précis (Fig. 5d et Fig. Supplémentaire). 9c, d). Par exemple, dans le cas de cellules PC9 traitées avec du paclitaxel, des mesures de masse sur 24 h définissent avec précision un point d'inflexion dose-réponse révélant des concentrations efficaces du médicament, malgré des changements minimes de viabilité observés à toutes les concentrations testées et des mesures de CI50 nécessitant 72 h pour une lecture plus précise (Fig. 5d). Lorsque cette comparaison est effectuée sur 60 médicaments différents testés sur 12 lignées cellulaires différentes, la valeur de ce signal de réponse de masse à manifestation rapide est clairement établie (Fig. 5e et Données supplémentaires 1). Pour de nombreux médicaments, qu'il s'agisse d'inhibiteurs de kinases ciblés ou de chimiothérapies, une valeur IC50 sur 24 h est comparable à la réponse de masse mesurée avec un signal basé sur la masse se développant à des doses identiques ou légèrement inférieures du médicament à celles observées par les mesures de viabilité. Cependant, pour les médicaments qui agissent par des mécanismes à action plus lente tels que l'arrêt du cycle cellulaire, les mesures de réponse de masse sur 24 h définissent toujours les concentrations efficaces de médicament, alors que les mesures de la CI50 sur 24 h offrent peu de perspective. Au lieu de cela, des points de temps IC50 de 72 h ou plus doivent être pris pour définir la sensibilité cellulaire à ces médicaments (Fig. 5e). Cette capacité à détecter rapidement les changements induits par les médicaments dans le phénotype cellulaire est particulièrement bénéfique dans le contexte des mesures de tissus primaires où les incubations de médicaments à plus long terme sont impossibles en raison de la dérive phénotypique et de la perte de viabilité ex vivo.

Le signal de réponse de masse varie avec les changements de dose ou le moment de la mesure, similaire aux mesures de viabilité cellulaire. Réponse de masse des cellules MM1S traitées avec du carfilzomib montrée lorsqu'une dose variable à un point de temps de 15 h ou un point de temps variable avec une dose de 150 nM. Plusieurs points indiquent des instruments indépendants, les lignes superposées indiquent un intervalle de confiance de 95 % pour la réponse de masse définie par 5 000 échantillons aléatoires de 2 500 cellules. c Cellules MM1S traitées avec le médicament à action rapide vénétoclax pendant 15 h, et d Cellules PC9 traitées avec le médicament à action lente paclitaxel pendant 24 h, en comparant la réponse à la dose mesurée en masse (axe rouge, les carrés rouges montrent des mesures représentatives de la réponse de masse, les lignes superposées indiquent un intervalle de confiance de 95 %), ou une évaluation de la viabilité basée sur la cytométrie en flux à l'aide de DAPI et d'annexine V (axe bleu, cercles bleus, lignes superposées indiquent un intervalle de confiance de 95 %) (Méthodes). e Carte thermique montrant une réponse de masse des lignées cellulaires (légende du haut) à 60 médicaments différents, comparant l'ampleur de la réponse (gradient rouge ; déterminée par la différence entre le contrôle et les conditions de test) pour des doses classées à 24 h IC50 (noir lignes) ou valeurs IC50 à long terme (cercles vides). Les valeurs de CI50 à long terme ne sont fournies que pour les médicaments dont la CI50 sur 24 h est infinie ou supérieure à la concentration utilisable la plus élevée pour les tests. Les médicaments sont classés en abscisse par rapport à leurs valeurs de CI50 sur 24 h. La réponse de masse observable à des doses inférieures aux mesures d'IC50 à court et à long terme pour une combinaison cellule/médicament donnée indique que les changements de masse correspondent ou précèdent la perte de viabilité pour tous les médicaments présentés. *** indique p < 0,001, ns indique p > 0,05.

Alors que les lignées cellulaires homogènes fournissent un bon contexte pour sonder les caractéristiques fondamentales des mesures de réponse de masse, elles ne sont pas de bons proxys pour l'hétérogénéité observée dans les échantillons de tumeurs primaires. Pour cette raison, il est important d'évaluer l'impact de l'hétérogénéité sur les mesures de réponse de masse. Cette variable peut être sondée explicitement en mélangeant les fractions traitées avec le médicament et le véhicule de la même lignée cellulaire, démontrant qu'à un moment donné, la réponse de masse augmente proportionnellement à la fraction de cellules répondant (Fig. 6a). Un modèle plus complexe est nécessaire pour émuler la distribution de taille hétérogène et la sensibilité aux médicaments dans un échantillon primaire. Pour tester la sensibilité fractionnelle avec cette hétérogénéité à l'esprit, nous avons utilisé un mélange de trois lignées cellulaires, chacune avec une sensibilité unique à un médicament individuel (Fig. 6b). Lorsque nous observons une réponse en utilisant des combos à 1 médicament contre, 2 ou 3 médicaments, nous constatons un changement additif dans la réponse de masse qui correspond à peu près à la somme des réponses pour chaque médicament en monothérapie (Fig. 6b).

a Mesures de réponse de masse prises sur des cellules MM1S, où le contrôle du véhicule et les cellules traitées au carfilzomib ont été mélangés après le traitement pour créer des populations cellulaires avec des fractions définies de cellules répondantes. b Une combinaison 1:1:1 de cellules MM1S, H929 et KMS-12-PE traitées pendant 15 h avec des thérapies à agent unique, double ou triple, démontrant le signal additif observé lorsque la fraction sensible des cellules augmente en réponse à un traitement combiné. Plusieurs points indiquent des instruments indépendants, les lignes superposées indiquent un intervalle de confiance de 95 % pour la réponse de masse définie par 5 000 échantillons aléatoires de 2 500 cellules. *** indique p < 0,001, ns indique p > 0,05.

Ces résultats démontrent un degré élevé de concordance entre les mesures de réponse de masse et d'autres tests de réponse aux médicaments existants et montrent que la réponse de masse peut caractériser avec précision les effets du temps, de la dose et de l'hétérogénéité de l'échantillon. La teneur en informations plus élevée offerte par les mesures de réponse de masse unicellulaire et leur capacité unique à résoudre la sensibilité cellulaire à des moments antérieurs en amont de la perte de viabilité offrent des avantages évidents dans la caractérisation des cellules tumorales primaires où le maintien à plus long terme des cellules ex vivo n'est pas pratique.

La composition de l'échantillon et la faisabilité de la collecte varient considérablement selon les différents formats d'échantillons cliniques et peuvent affecter la facilité d'isolement et de mesure des cellules. Un pipeline de tests fonctionnels doit donc être compatible avec des échantillons prélevés dans une variété de compartiments de cellules tumorales afin de maintenir une large applicabilité à travers les tumeurs malignes.

Des travaux antérieurs ont démontré la faisabilité d'utiliser des mesures de réponse de masse pour caractériser l'efficacité des médicaments pour les formats d'échantillons de malignité hématologique tels que le sang et la moelle osseuse21. Tout en fournissant une preuve de concept encourageante que de telles lectures biophysiques peuvent prédire avec précision les réponses des patients au traitement, la complexité technique du traitement des échantillons de tumeurs solides nous a amenés à tester si notre flux de travail de mesure de masse annoté par image pouvait maintenir la capacité de caractériser la sensibilité aux médicaments tout en offrant également la rapidité, la robustesse et la reproductibilité technique requises pour un pipeline de tests cliniques (Fig. 2b supplémentaire).

Pour démontrer d'abord la compatibilité de ce flux de travail avec des échantillons de tumeurs hématologiques, nous présentons les mesures d'un échantillon de sang périphérique d'un patient atteint de leucémie plasmocytaire (PCL) et d'un prélèvement de moelle osseuse d'un patient atteint de myélome multiple (MM) (Fig. 7a , b). Dans les deux cas, les réponses de masse cellulaire étaient observables pour une gamme de thérapies. Les cellules tumorales isolées de l'échantillon de PCL avec une démonstration préalable de la translocation t(11;14) ont montré une réponse dose-dépendante au vénétoclax en monothérapie et en association avec le bortézomib et le selinexor. Cependant, ces cellules n'ont pas montré de réponse de masse significative au sélinexor ou au bortézomib seuls, ce qui suggère que la réponse était principalement due au vénétoclax. Ce patient avait déjà été traité avec une thérapie à base de vénétoclax et avait une bonne réponse pendant cinq mois, comme indiqué par l'éradication du clone t(11;14) dans les biopsies diagnostiques ultérieures de la moelle osseuse. Cependant, le traitement a été arrêté après cinq mois en raison d'effets indésirables (cytopénies). L'échantillon d'aspiration de moelle osseuse d'un patient atteint d'un myélome multiple en rechute ou réfractaire avec une atteinte extramédullaire connue a démontré une réponse dose-dépendante à l'association de sélinexor, de carfilzomib et de dexaméthasone, ainsi qu'à l'association de thérapie DCEP (dexaméthasone, cyclophosphamide, étoposide et cisplatine ). Lorsqu'elle est administrée en monothérapie, la plupart de la réponse de masse observée avec la thérapie combinée a été récapitulée par l'administration de l'analogue du cyclophosphamide, le mafosfamide, un composé s'hydrolysant spontanément qui produit les deux mêmes composants que le cyclophosphamide métabolisé35. Comme pour les mesures prédictives antérieures dans le myélome multiple, les mesures de la réponse de masse du DCEP étaient cohérentes avec la diminution de la protéine monoclonale sérique du patient et sa réponse au traitement par chimiothérapie combinée de sauvetage.

Des mesures de réponse de masse ont été recueillies pour des cellules de leucémie à plasmocytes (PCL) isolées d'un échantillon de sang périphérique et traitées pendant 15 h avec les médicaments énumérés, b des cellules de myélome multiple isolées d'un échantillon d'aspiration de moelle osseuse et traitées pendant 15 h avec les médicaments énumérés , c cellules isolées à partir d'échantillons d'aspiration à l'aiguille fine (FNA) prélevés à partir d'une masse pulmonaire, d'une masse cervicale et d'une masse osseuse de tissus mous chez trois patients différents atteints respectivement d'un cancer du poumon non à petites cellules, d'un mélanome et d'un cancer du sein, et traités pour 20 h avec les médicaments listés, et d cellules de cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) isolées d'un échantillon d'épanchement pleural et traitées pendant 20 h avec les médicaments listés. Pour toutes les parcelles, chaque point représente la réponse de masse mesurée dans un instrument individuel, avec des barres d'erreur correspondant à l'intervalle de confiance à 95 % pour la réponse de masse définie par 5 000 échantillons aléatoires de 2 500 cellules. *** indique p < 0,001, ** indique p < 0,01, * indique p < 0,05, ns indique p > 0,05.

Pour les patients atteints de tumeurs malignes solides récidivantes ou métastatiques, l'évaluation clinique nécessite souvent le prélèvement d'échantillons de tissus solides plutôt que d'échantillons de sang ou de moelle osseuse. La collecte de ces spécimens au moyen de résections chirurgicales ou parfois même de biopsies au trocart est impossible compte tenu de la taille et de la localisation anatomique des lésions métastatiques et du désir d'éviter les procédures invasives inutiles. L'aspiration à l'aiguille fine (FNA), qui utilise des aiguilles à profil plus bas que les biopsies au trocart, offre une alternative peu invasive au prélèvement d'échantillons et réduit le risque de saignement et de blessure36. Pour assurer une utilité clinique maximale, nous avons cherché à déterminer la faisabilité d'effectuer des mesures de réponse de masse à l'aide de ces échantillons FNA à faible apport, qui ne produisent souvent que des dizaines de milliers de cellules individuelles pour une analyse en aval.

Nous avons collecté des échantillons de FNA à partir de trois localisations anatomiques différentes : une masse pulmonaire chez une patiente atteinte d'un cancer du poumon non à petites cellules (CBNPC), une masse cervicale chez une patiente atteinte d'un mélanome et une masse osseuse lytique des tissus mous chez une patiente atteinte d'un cancer du sein ( figure 7c). Les rendements cellulaires totaux étaient de 115, 25 et 120 000 cellules tumorales pour les masses pulmonaire, osseuse et cervicale, respectivement. Ces échantillons ont démontré une gamme de réponses de masse cellulaire aux médicaments, la masse pulmonaire montrant une réponse de masse significative au paclitaxel et à la gemcitabine, la masse du cou montrant une réponse de masse significative à une combinaison de dabrafenib et de trametinib, et la masse osseuse des tissus mous ne montrant aucune réponse de masse significative. réponse au docétaxel ou à la doxorubicine. Fait intéressant, le patient atteint de NSCLC a ensuite été traité avec une combinaison de carboplatine et de paclitaxel et a démontré une réponse clinique marquée, cohérente avec la réponse de masse au paclitaxel notée pour cet échantillon. Ces mesures démontrent la faisabilité d'effectuer le flux de travail de bout en bout avec des formats de tissus à faible apport et indiquent que le pipeline est compatible avec la réalisation de tests de réponse aux médicaments dans les limites des stratégies de gestion clinique actuelles pour les patients atteints de tumeurs malignes solides avancées.

En plus des lésions métastatiques disséminées, de nombreux patients atteints de cancer avancé accumulent des fluides malins sous forme d'épanchements pleuraux ou d'ascites abdominales, qui provoquent une gêne importante et doivent être drainés pour des raisons diagnostiques et thérapeutiques afin de gérer les symptômes37. Étant donné que ces fluides malins contiennent des cellules tumorales, ils offrent un autre format d'échantillon potentiel pour les tests de réponse aux médicaments peu invasifs. Après les protocoles standard d'enrichissement des cellules tumorales (Méthodes), ces échantillons produisent souvent un nombre important de cellules pour la mesure. Par exemple, chez un patient atteint d'un cancer du poumon non à petites cellules avancé, un échantillon de 150 ml d'épanchement pleural malin a produit près de 170 millions de cellules tumorales, plus que suffisant pour effectuer des tests de réponse de masse pour un panel de médicaments (Fig. 7d). Ce patient suivait un traitement par capmatinib en raison d'une mutation confirmée de saut de l'exon 14 de MET, mais n'avait pas répondu à ce traitement au moment du prélèvement de l'épanchement. Les mesures de réponse de masse recueillies sur les cellules tumorales isolées de l'échantillon d'épanchement étaient cohérentes avec ce résultat clinique, ne révélant aucune réponse de masse significative au capmatinib à des doses allant de plusieurs ordres de grandeur. Cependant, ces cellules n'étaient généralement pas insensibles à tous les traitements, montrant des réponses de masse significatives et dépendantes de la dose d'amplitudes variables à des thérapies telles que le paclitaxel, le docétaxel et le cisplatine (Fig. 7e et Fig. 10a supplémentaire). Conformément aux mesures des lignées cellulaires de médicaments taxanes à action plus lente, y compris le paclitaxel et le docétaxel, les réponses de masse détectées pour ces médicaments n'étaient pas observables avec les mesures de viabilité basées sur la cytométrie en flux collectées pour ce même échantillon (Fig. 10b supplémentaire). Ces résultats démontrent la faisabilité de collecter des mesures de réponse de masse avec des échantillons de fluide malin et fournissent un exemple de l'hétérogénéité de la réponse médicamenteuse qui peut être révélée en mesurant directement les cellules tumorales primaires. De plus, ils démontrent le potentiel de cette nouvelle approche pour compléter les biomarqueurs génomiques existants, qui, comme dans le cas de ce patient, n'identifient pas toujours une thérapie efficace.

Le flux de travail présenté ici s'appuie sur les efforts récents en médecine de précision fonctionnelle pour le cancer10,11,12,13,14,15,16,17 et offre des développements translationnels supplémentaires clés vers des conseils thérapeutiques rapides largement applicables pour les soins cliniques contre le cancer. Nous avons démontré la faisabilité de collecter des mesures de réponse aux médicaments dans des formats d'échantillons cyto-dilués et peu invasifs utilisés pour échantillonner des tumeurs solides telles que FNA et des fluides malins, en plus de ceux couramment utilisés dans l'étude des hémopathies malignes, y compris le sang et la moelle osseuse. . Les améliorations techniques décrites ici, y compris la classification des images pour la conservation des mesures et l'approche statistique, aident à identifier les réponses au traitement en utilisant un nombre limité de cellules provenant d'un échantillon primaire hétérogène et labile. La réduction du bruit de fond dans les échantillons primaires permise par ces avancées permet également de raccourcir le délai d'exécution du test à 2 jours en limitant la durée d'exposition au médicament nécessaire pour observer la réponse.

En plus de démontrer une large utilité dans diverses tumeurs malignes et formats d'échantillons, nous avons également montré que ce flux de travail peut être utilisé pour identifier les réponses de masse pour un large éventail de thérapies. Malgré des mécanismes d'action uniques et des effets différents sur les propriétés biophysiques cellulaires, les mesures de masse unicellulaire ont pu identifier des réponses dose-dépendantes dans les lignées cellulaires pour toutes les principales classes de médicaments testées ici. De plus, à quelques exceptions près, ces réponses de masse étaient observables dans les 24 h, souvent avant qu'un signal significatif ne puisse être détecté avec des mesures alternatives basées sur la viabilité. Pour les médicaments à action exceptionnellement lente, tels que l'antimétabolite 5-fluorouracile, bien que la réponse de masse n'ait été observable qu'environ 48 h après le traitement, cela a précédé tout changement observable de la viabilité cellulaire, tel qu'évalué par cytométrie en flux (Fig. 9c supplémentaire). Ensemble, ces résultats suggèrent que les mesures de réponse de masse offrent un degré de généralisabilité comparable aux tests de réponse médicamenteux de référence existants, basés sur la viabilité, tout en permettant une lecture plus rapide de la réponse dans de nombreux contextes - un ensemble essentiel de caractéristiques lors de la caractérisation d'échantillons cliniques hétérogènes qui peuvent subir une dérive phénotypique rapide ex vivo38,39.

Comme avec d'autres approches de mesure de la réponse aux médicaments, il existe certaines limites à l'utilisation de la réponse de masse pour un guidage thérapeutique rapide. Par exemple, en raison de l'isolation des cellules tumorales et des approches de dosage des médicaments utilisées dans ce flux de travail, il est optimisé pour caractériser les médicaments avec des mécanismes d'action intrinsèques aux cellules tumorales. Les thérapies qui agissent principalement par des moyens intrinsèques non cellulaires, tels que les médicaments anti-angiogéniques qui nécessitent un remodelage physiologique (par exemple, le bevacizumab) ou les thérapies endocriniennes qui ciblent indirectement les cancers à récepteurs hormonaux positifs (par exemple, les inhibiteurs de l'aromatase), sont actuellement incompatibles avec ce flux de travail . Cependant, certains types de thérapie, y compris les médicaments immuno-oncologiques tels que les inhibiteurs de points de contrôle, peuvent nécessiter une modification moins importante du pipeline pour mettre en œuvre des mesures efficaces de réponse aux médicaments. Bien que ces thérapies agissent par des mécanismes intrinsèques aux cellules non tumorales, des travaux antérieurs ont démontré que la masse unicellulaire fournit également une lecture de l'état fonctionnel des cellules immunitaires21,22. Le flux de travail présenté ici se prête à la mesure directe de ces effets médicamenteux intrinsèques aux cellules immunitaires.

La nature unicellulaire de ce pipeline de mesure de masse offre des opportunités techniques supplémentaires à l'avenir. Par exemple, l'imagerie liée a été utilisée ici pour la classification des particules et l'amélioration de la qualité des données de mesure de masse, mais l'accès optique offert par cette plate-forme est compatible avec d'autres approches de lecture unicellulaire liées, y compris l'analyse d'images en fond clair pour l'extraction de caractéristiques ou la détection de fluorescence pour l'immunophénotypage. . En combinaison avec les développements de la manipulation fluidique, ces améliorations optiques peuvent conduire à des exigences de nombre de cellules inférieures pour les futures versions du test. En tant que méthode non destructive, ces mesures de masse unicellulaire peuvent également être collectées en amont de lectures moléculaires unicellulaires multi-omiques liées, comme cela a été démontré précédemment avec le scRNA-seq22 apparié. De même, les mesures de réponse de masse collectées pour un échantillon de tumeur primaire peuvent être utilisées pour compléter les résultats génomiques collectés pour le même patient, soit simultanément pour améliorer la précision prédictive, soit en aval pour sélectionner l'inhibiteur optimal pour une altération génomique donnée. Dans les deux cas, les mesures de masse unicellulaire offrent une évaluation fonctionnelle de la réponse thérapeutique pour analyser davantage les déterminants biologiques sous-jacents de la sensibilité aux médicaments, offrant des avantages potentiels importants pour la prise de décision clinique et le développement de médicaments anticancéreux.

En tant que test fonctionnel ciblant un large éventail de malignités et de mécanismes médicamenteux, cette approche présente des défis uniques. Par exemple, la portée des tests de réponse aux médicaments possibles pour un échantillon primaire donné dépend largement de la quantité totale de cellules tumorales disponibles après le traitement. Comme on peut le voir dans la Fig. 7 et la Fig. test pour différents types d'échantillons. Les cellules tumorales isolées à partir d'échantillons primaires peuvent également avoir une pureté et une viabilité très variables d'un échantillon à l'autre, une autre considération clé pour la mise en œuvre clinique de ce flux de travail (Note complémentaire 1).

L'interprétation des données de réponse de masse recueillies pour ces échantillons primaires est également un axe de développement clé de cette approche à mesure qu'elle se déplace vers la clinique. Alors que nous nous sommes concentrés ici sur une simple évaluation binaire de la réponse et de la non-réponse basée sur une comparaison de distance statistique, les travaux futurs se concentreront sur la valeur de la prise en compte de l'ampleur de la réponse ou d'autres caractéristiques de distribution de masse unicellulaire pour capturer la profondeur ou la durabilité. de réponse clinique. Des ensembles de données de validation adaptés au contexte sont nécessaires pour garantir que le test identifie correctement la réponse et la non-réponse cliniquement pertinentes. Ces spécifications de limite de décision spécifiques aux médicaments et aux tumeurs malignes sont au centre de plusieurs études prospectives en cours sur la leucémie myéloïde aiguë, le myélome multiple et les tumeurs solides, y compris le cancer du sein et du poumon (NCT04985357 et NCT03777410). Le travail présenté ici a permis l'intégration de ce test dans un flux de travail robuste et évolutif certifié CLIA pour ces études de validation clinique et futures.

Cette démonstration de faisabilité clinique, en plus des propriétés fondamentales des mesures de réponse de masse - utilité indépendante des médicaments et des malignités, compatibilité avec la petite taille de l'échantillon et délai d'exécution rapide - représente une étape importante vers l'impact clinique général d'un test fonctionnel sur le patient se soucier.

Nous utilisons la technologie SMR pour effectuer des mesures unicellulaires d'une manière similaire à ce qui a été précédemment présenté23,28, à des débits supérieurs à 80 nl/s et avec une précision de masse inférieure à 0,5 pg. Différente des études précédentes, la configuration de mesure utilisée pour cette étude est un instrument intégré qui contrôle le capteur SMR et la fluidique associée. Treize instruments SMR identiques ont été utilisés pour collecter les données présentées dans cet article. Chaque instrument est équipé d'une configuration de contrôle fluidique basée sur la pression et le débit, d'un contrôleur de température pour maintenir la puce SMR stable à température ambiante, d'un contrôleur FPGA ainsi que d'une lecture personnalisée et d'une électronique de commande pour contrôler le capteur SMR et enregistrer des données similaires à celle décrit dans Olcum et al.40, une unité d'imagerie pour capturer des images de cellules individuelles lorsqu'elles traversent le SMR et un ordinateur pour exécuter le logiciel de contrôle et d'analyse. Le SMR et les sous-unités du prototype sont contrôlés par un logiciel personnalisé développé dans l'environnement LabView. Le logiciel guide automatiquement le technicien à travers les étapes d'étalonnage, d'amorçage fluidique, de mesure de cellule et de nettoyage séquentiellement. L'étape de nettoyage est effectuée entre chaque condition médicamenteuse mesurée pour empêcher la contamination entre les mesures. Les réglages et les paramètres de mesure des instruments sont identiques sur tous les instruments SMR et sont extraits par le logiciel de contrôle d'un serveur local. De plus, le logiciel de contrôle est équipé de routines automatiques telles que le retour d'écoulement pour la prévention du colmatage, le chargement automatique des échantillons pour minimiser les déchets et les routines de nettoyage pour augmenter la vitesse et la fiabilité.

Dans ce travail, nous utilisons la distance Earth Mover (EMD), également connue sous le nom de première distance de Wasserstein, pour quantifier la différence des distributions de masse en tant que "réponse de masse". L'EMD possède les propriétés d'une métrique idéale pour quantifier les différences dans les distributions cellulaires41 telles que la linéarité, l'invariance de la traduction, la symétrie, et est robuste aux petites différences de distributions dues à la dérive des instruments, au bruit de mesure ou à d'autres sources de variabilité42. Comme suggéré par Orlova et al.42, l'EMD répond à toutes les exigences indiquées ci-dessus et est efficace en termes de calcul pour exécuter des données unidimensionnelles telles que les mesures de masse unicellulaires43.

Pour définir le signal de réponse de masse comme une métrique normalisée et sans dimension pour comparer les distributions de masse, nous introduisons la notation suivante (Eq. 1) :

où X et Z sont des mesures de masse unicellulaires triées des cellules de référence traitées avec le médicament et le véhicule, respectivement, et \(N\) est le nombre de cellules dans chaque distribution42. (La réponse de masse est également calculée pour les cas où X et Z ont des tailles différentes. Dans l'équation ci-dessus, nous supposons N pour les deux par souci de simplicité.)

Nous calculons l'intervalle de confiance à 90 % du signal de réponse de masse à l'aide de méthodes bootstrap non paramétriques, car nous ne pouvons pas nous attendre à des distributions gaussiennes (ou autres connues) pour la masse cellulaire. Plus précisément, la méthode BCa (correction du biais et accélérée) est utilisée pour estimer les intervalles de confiance avec des probabilités de couverture précises sur toute la plage du signal de réponse de masse44. Pour toutes les réponses de masse rapportées dans cet article, \(N=2500\) cellules et le nombre de répliques bootstrap pour l'intervalle de confiance de la réponse de masse est \(R=5000\) sauf indication contraire explicite.

La structure proposée pour mesurer la réponse de masse (Fig. 2c, d) nous permet de tester la signification biologique du signal de réponse de masse mesuré par opposition à la comparaison directe des mesures unicellulaires à l'aide d'un test statistique. Étant donné que le nombre de cellules mesurées (\(N\)) pour représenter chaque population de cellules est de l'ordre de milliers, de petits écarts dans les distributions de masse dus à une erreur d'échantillonnage, au bruit de l'instrument ou à la dérive phénotypique peuvent s'avérer statistiquement significatifs. De tels écarts peuvent cependant être statistiquement significatifs sans représenter un signal biologiquement significatif45. Pour contourner ce problème, nous définissons la statistique de test, \(\theta\), comme étant la différence entre deux signaux de réponse de masse, c'est-à-dire CTRL et TEST, comme illustré à la Fig. 2d, et vérifions si \(\theta\) est supérieure à la limite du seuil de décision. D'où (Eq. 2):

où \(Y\) est les mesures de masse triées des cellules témoins traitées avec le véhicule et \(X\) et \(Z\) sont définis comme ci-dessus. Le deuxième terme de l'équation est la distance entre les cellules de référence et de contrôle mesurée à différents moments dans le temps (Fig. 2c). La statistique de test est donc la distance des cellules traitées avec le médicament aux cellules de référence traitées avec le véhicule par rapport à la "dérive phénotypique" (le cas échéant) dans les cellules témoins sur la durée du test. Même en l'absence de dérive, le deuxième terme capture le bruit naturel inhérent à l'estimation de la distance entre deux échantillons finis de la même distribution.

Pour tester la sensibilité des cellules cancéreuses au traitement, nous comparons le signal, \(\theta\), à un seuil, \({\theta }_{0}\)—la "limite de décision" biologiquement significative—appropriée pour le classe de médicaments en cours d'évaluation. Il est difficile, en général, de faire des tests d'hypothèses non paramétriques pour les valeurs nulles non nulles. Comme l'a déclaré Chernick, "l'utilisation de statistiques asymptotiquement pivots et le centrage de la distribution sous l'hypothèse nulle"46 sont particulièrement importants dans les tests d'hypothèses. Conformément à la déclaration, nous utilisons la méthode bootstrap-t comme indiqué ici. En utilisant la dérivation de Davison et al.29, nous introduisons un pivot, c'est-à-dire une combinaison de données et de paramètres dont la distribution est indépendante d'un modèle sous-jacent (Eq. 3),

où \(\hat{\theta }\) est le signal observé, \(\theta\) est le vrai signal (non observable) et \(S\) est l'erreur type de \(\hat{\theta }\ ). Dans cette formulation, \(T\) est asymptotiquement gaussien. Dans le travail présenté ici, \(\hat{\theta }\) est mesuré à partir de \(N=2500\) cellules chacune des populations de référence, de contrôle et de test. \(S\) est estimé en utilisant \(r=19\) réplicants bootstrap de \(\hat{\theta }\).

Pour tester l'hypothèse nulle \({H}_{0} :\theta \le {\theta }_{0}\), nous remplaçons \({\theta }_{0}\) par \(\theta\ ) et la valeur observée du pivot sous le zéro devient (Eq. 4) :

Pour faire le test d'hypothèse, nous comparons \({t}_{{{{{{{\mathrm{obs}}}}}}}}\) à une simulation bootstrap de \(T\) (Eq. 5) :

où S* est l'erreur estimée du réplicant bootstrap, \({\hat{\theta }}^{* }\). Puisque \({S}^{* }\) est, encore une fois, trouvé par bootstrap, nous avons une méthode "embedded bootstrap". Nous avons utilisé \(R=\,999\) itérations de \({\hat{\theta }}^{* }\) et, pour chacune d'elles, \(r=\,19\) itérations pour estimer \( {S}^{* }\).

La valeur \(p\), c'est-à-dire la probabilité d'obtenir le résultat observé étant donné que l'hypothèse nulle est vraie, est alors (Eq. 6) :

où \(\Pr \left(x\right)\) est la probabilité que \(x\) soit vrai et \(\#[{x}^{* }]\) est le nombre de variantes bootstrap pour lesquelles \ (x\) est vrai. Pour le nombre d'itérations choisi, \(R\), la valeur \(p\) minimale réalisable est de 0,001. Nous comparons la valeur \(p\) résultante au niveau de signification habituel de 5 %, c'est-à-dire \(p\,{{{{{\rm{value}}}}}} \, < \, 0,05\), pour déterminer si l'hypothèse nulle peut être rejetée.

Les images collectées de divers types de cellules sur les instruments SMR ont été sélectionnées manuellement pour générer des ensembles d'entraînement d'au moins 10 000 images pour chaque classe d'images (cellule intacte, cellule perméable, débris et agrégat). Trois modèles CNN de classification binaire différents ont ensuite été générés à l'aide de la bibliothèque Keras (2.3.1) en Python (3.7.7). Ceux-ci incluent (1) un modèle d'acceptation/rejet qui utilise à la fois des images de cellules intactes et perméables comme événements "acceptés" et des images de débris et d'agrégats comme événements "rejetés" pendant la formation, (2) un modèle intact/perméable, et (3) un modèle agrégat/débris. Pour la formation, nous avons utilisé l'augmentation d'image pour améliorer la robustesse des modèles finaux. Cette augmentation comprenait le retournement vertical et horizontal aléatoire des images, le réglage de la luminosité et la rotation. Chaque modèle a été entraîné à l'aide de 90 % des images de chaque ensemble d'entraînement organisé, les 10 % restants étant utilisés pour la validation croisée afin de tester les performances du modèle. La précision et le rappel de cette validation croisée sont rapportés à la Fig. 3. Les images ont été classées en deux étapes, en utilisant d'abord le classificateur d'acceptation/rejet, puis en annotant davantage les particules acceptées avec le classificateur intact/perméable et les particules rejetées avec les débris/ agrégat.

Les cellules A549, PC9, MDA-MB-361, PA-TU-8902, HT-29, NCI-H1666, NCI-H2228, MM.1S, MM.1R, H929, U266 et KMS-12-PE ont été maintenues dans un milieu de base additionné de sérum bovin fœtal (FBS ; Sigma Aldrich, Cat#F4135), d'antibiotique-antimycosique (Gibco, Cat#15240062) et d'HEPES (Gibco, Cat#15630080), et conservé dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5% CO2. Le milieu de base était soit RPMI1640 + GlutaMAX (Gibco, Cat#61870), DMEM + glucose + GlutaMAX (Gibco, Cat#10566024), soit McCoy's 5 A Medium (ATCC, Cat#302007). Les cellules H929 ont été cultivées dans des milieux additionnés de 2-mercaptoéthanol (Sigma, Cat # 97622). Pour le passage, les lignées cellulaires adhérentes ont été traitées avec 0,25% de trypsine-EDTA (Gibco, Cat # 25200) comme recommandé par le fabricant. Les lignées cellulaires ont été obtenues auprès de l'ATCC, du DSMZ ou de l'ECACC, à l'exception des cellules KMS-12-PE, qui ont été reçues dans le cadre d'une collaboration avec le Parekh Lab du MSSM. Toutes les lignées cellulaires ont été testées négatives pour les mycoplasmes sur une base mensuelle.

Les médicaments ont été obtenus auprès de MedChemExpress ou SelleckChem sous forme de poudres lyophilisées et ont été reconstitués dans un solvant approprié et stockés sous forme d'aliquotes à usage unique à -80 ° C pour une utilisation à long terme. Pour les tests de réponse de masse, les cellules ont été dosées à 2 × 105 cellules/mL et ont été dosées aux concentrations de médicament déterminées pendant la durée spécifiée. Les cellules témoins ont été dosées à 0,25 % de DMSO (véhicule témoin). Les cellules ont ensuite été étalées dans des plaques de polystyrène standard à 6 ou 12 puits et incubées pendant la période spécifiée. Pour les lignées cellulaires en suspension, au moment de la mesure, les cellules ont été délicatement remises en suspension, rincées avec un milieu complet, centrifugées pendant 5 min à 300 × g et remises en suspension dans un milieu pour la mesure. Pour les cellules de lignées cellulaires adhérentes, au moment de la mesure, le surnageant de chaque puits a été collecté, le puits a été rincé avec du PBS et les cellules ont été détachées en utilisant 0, 25% de trypsine-EDTA (Gibco, Cat # 25200) pendant 7 min. Les cellules détachées ont ensuite été combinées avec le surnageant de chaque puits, centrifugées pendant 5 min à 300 × g et remises en suspension dans le milieu de mesure. Les cellules primaires isolées ont été étalées dans des plaques lo-bind de 24 ou 96 puits (Corning : Cat# 3473), et après incubation, les cellules ont été doucement remises en suspension, rincées avec du milieu complet, centrifugées pendant 5 min à 300 × g et remises en suspension dans un milieu de mesure.

Des échantillons de cancer primaire ont été prélevés sur des patients après avoir fourni leur consentement éclairé et conformément aux protocoles approuvés par l'IRB (WCMC IRB # 0010004608, ISMMS IRB # STUDY-18-00456, CSHRI IRB # 1738582-3). Une fois l'échantillon primaire prélevé, l'expéditeur a été renvoyé pendant la nuit au laboratoire de Travera pour traitement. Tous les échantillons de FNA et de fluide malin ont été expédiés dans des expéditeurs maintenant 4 ˚C (FedEx, unité de refroidissement de durée standard). Les aspirations à l'aiguille fine ont été remises en suspension dans HypoThermosol (BioLife Solutions) pour être conservées pendant l'expédition. Les échantillons de sang et de moelle osseuse ont été placés dans des tubes d'échantillons cliniques d'héparine de sodium à bouchon vert (BD Vacutainer) et expédiés dans des expéditeurs à température ambiante contrôlée maintenant des températures comprises entre 15 et 20 °C (Inmark Life Sciences). Chaque expéditeur a par ailleurs été préparé conformément à la réglementation pour une expédition de catégorie B de substances biologiques.

Les échantillons de sang et de moelle osseuse ont été traités par filtration en amont à travers un filtre à mailles de 70 µm (pluriSelect), suivie d'une centrifugation en gradient de densité Ficoll (Sigma Aldrich). Les populations de cellules mononucléaires ont ensuite été soumises à une sélection positive à l'aide de microbilles magnétiques CD138+ ou CD33+ (Miltenyi) et séparées à l'aide d'un séparateur AutoMACS Pro (Miltenyi) selon les protocoles du fabricant. Les cellules purifiées ont été remises en suspension dans du milieu RPMI additionné de Glutamax et de 10 % de FBS. Les échantillons d'aspiration à l'aiguille fine ont d'abord été soumis à une lyse des globules rouges (BD PharmLyse), suivie d'une digestion mécanique et enzymatique à l'aide du kit de dissociation de tumeur humaine Miltenyi selon le protocole du fabricant. Les cellules tumorales ont ensuite été purifiées à l'aide du kit d'isolement de cellules tumorales humaines Miltenyi en suivant le protocole du fabricant. De même, des échantillons d'épanchement pleural ont d'abord été soumis à une lyse des globules rouges, suivie d'un isolement de cellules tumorales à base de MACS à l'aide du même kit d'isolement de cellules tumorales Miltenyi. Pour les échantillons de FNA et d'épanchement, les cellules tumorales enrichies ont été remises en suspension dans du milieu DMEM avec Glutamax et 20 % de FBS.

La réponse de viabilité des cellules a été évaluée à l'aide de CellTitre-Glo 2.0 (Promega, Cat # G9242) et la luminescence a été quantifiée par un lecteur de plaques. Les cellules ont été étalées en triple dans une plaque à 96 puits à fond plat (Corning, Cat # 3903) à des concentrations de départ de 2 × 104 ou 2 × 105, selon le temps de doublement des cellules. Les traitements médicamenteux ont été évalués entre 24 et 144 h. Toutes les mesures ont été effectuées selon le protocole du fabricant.

Toutes les mesures de cytométrie en flux ont été effectuées sur un cytomètre MACSQuant 10 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). L'analyse des données a été réalisée avec FlowJo (10.8.1). La viabilité cellulaire a été évaluée en colorant les cellules avec l'Annexine V (Biolegend, CAT# 640945) et le 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) (Biolegend, CAT# 422801), les cellules viables ont été définies comme des cellules colorées négatives pour à la fois DAPI et Annexin V. Pour comparer les données de cytométrie en flux avec les données de masse (Fig. 5 et Fig. 9 supplémentaire), des sous-ensembles de 2500 cellules ont été échantillonnés au hasard à partir de chaque ensemble de données de cytométrie en flux 1000 fois pour définir un intervalle de confiance de 95% pour la viabilité cellulaire lectures. Ces mesures ont ensuite été comparées à la condition de contrôle en utilisant une limite de décision de 3 % (décrite ci-dessus pour les mesures de réponse de masse) pour déterminer les valeurs p. Pour comparer fidèlement l'ampleur de la réponse entre la cytométrie en flux et les lectures de masse, la limite de l'axe y pour les mesures de réponse de masse a été déterminée en trouvant la réponse de masse entre les événements d'image classés comme "Cellules" par rapport à "Perméable" dans la population témoin de cellules mesurées pour chaque expérience comme indicateur de perte de viabilité à 100 %, déterminée par cytométrie en flux (Fig. 4 supplémentaire).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Toutes les données sources pour les figures se trouvent dans les données supplémentaires 1.

Une correction à cet article a été publiée : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04376-8

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Les auteurs tiennent à remercier Scott Manalis et Keith Ligon pour leurs commentaires et discussions utiles. Ce travail a été soutenu par la phase I NCI SBIR 1R43CA228872-01A1 et la phase II NSF SBIR 2026060. Les chiffres ont été générés à l'aide de BioRender.com.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Robert J. Kimmerling, Mark M. Stevens, Selim Olcum.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Anthony Minnah, Madeleine Vacha, Rachel LaBella.

Travera, Medford, MA, États-Unis

Robert J. Kimmerling, Mark M. Stevens, Selim Olcum, Anthony Minnah, Madeleine Vacha, Rachel LaBella, Matthew Ferri, Steven C. Wasserman et Clifford A. Reid

Département de recherche clinique, Dignity Health, Sequoia Hospital, Redwood City, Californie, États-Unis

Juanita Fujii, Zayna Shaheen et Srividya Sundaresan

Weill Cornell Medicine, New York, NY, États-Unis

Drew Ribadeneyra, David S. Jayabalan, Ruben Niesvizky et Cara A. Rosenbaum

Département de médecine, d'hématologie et d'oncologie médicale, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, États-Unis

Sarita Agte, Adolfo Aleman & Samir Parekh

Tisch Cancer Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, États-Unis

Sarita Agte, Adolfo Aleman & Samir Parekh

École supérieure des sciences biomédicales, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, États-Unis

Adolfo Alemán

Département d'oncologie médicale, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, États-Unis

Joseph A. Criscitiello et Marlise R. Luskin

Precision Immunology Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, États-Unis

Samir Parek

Département des sciences oncologiques, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, États-Unis

Samir Parek

Division de radiologie vasculaire et interventionnelle, Palo Alto Medical Foundation, Redwood City, Californie, États-Unis

Anobel Tamrazi

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RJK, MMS, SO, MV, AM, RL et CAR ont défini la stratégie de recherche et conçu les expériences. RJK, AM, MV et RL ont réalisé des expériences. RJK, MMS, SO, AM, MV, RL et MF ont effectué une analyse des données. RJK, MMS, SO et SCW ont implémenté le matériel et les logiciels de la plate-forme. Collecte et expédition d'échantillons cliniques gérés par JF, ZS, SS, DR, DJ, SA, AA, JAC, RN, MRL, SP, CAR et AT, y compris l'identification du patient, le consentement du patient, la collecte et l'emballage des échantillons pour l'expédition, et l'annotation clinique du patient . RJK, MMS et SO ont préparé les figures et rédigé le manuscrit, avec les commentaires de tous les auteurs.

Correspondance à Robert J. Kimmerling ou Clifford A. Reid.

RJK, MMS, SO et CAR sont les fondateurs de Travera, qui commercialise la technologie SMR à des fins cliniques. RJK, MMS, SO, AM, MV, RL et CAR sont des employés de Travera. MF, SW et AT reçoivent des honoraires de consultation de Travera. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Toril Holien et Gene Chong. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Kimmerling, RJ, Stevens, MM, Olcum, S. et al. Un pipeline pour l'évaluation agnostique de la malignité et de la thérapie de la réponse aux médicaments anticancéreux à l'aide de mesures de la masse cellulaire. Commun Biol 5, 1295 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04270-3

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Reçu : 01 juin 2022

Accepté : 16 novembre 2022

Publié: 26 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04270-3

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