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Jul 26, 2023

Membrane nanoporeuse magnétique électrodéposée pour une haute

Volume Biologie des communications

Biologie des communications volume 5, Numéro d'article : 1358 (2022) Citer cet article

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Les nanobilles superparamagnétiques offrent plusieurs avantages par rapport aux microbilles pour l'immunocapture de nanoporteurs (vésicules extracellulaires, lipoprotéines et virus) dans un bioessai : capture à haut rendement, réduction du temps d'incubation et capacité de capture plus élevée. Cependant, les nanobilles sont difficiles à "abaisser" car leur caractéristique superparamagnétique nécessite des gradients de champ magnétique élevés à l'échelle nanométrique. Ici, une membrane électrodéposée et gravée sur piste est montrée pour produire un anneau nano-bord superparamagnétique unique avec plusieurs bords autour des nanopores. Avec un champ magnétique externe uniforme, le monopôle et le dipôle induits de cette nano jonction de bord se combinent pour produire une force de piégeage des nanobilles 10 fois plus élevée. Une suspension dense de nanobilles peut être filtrée à travers la membrane nanoporeuse magnétique (MNM) à haut débit avec un taux de capture de billes de 99 %. Le rendement en nanoporteurs spécifiques en milieu hétérogène par nanobilles/MNM dépasse 80%. La reproductibilité, la faible perte et les taux de capture indépendants de la concentration sont également démontrés. Ce matériau MNM élargit donc l'application de l'immunocapture de nanobilles aux échantillons physiologiques.

Les vésicules extracellulaires (VE) et les lipoprotéines sont des nanoparticules biologiques que l'on peut trouver dans divers fluides biologiques1,2,3. Leur fonction récemment découverte de livraison de cargaison moléculaire entre les cellules a catalysé une activité de recherche considérable dans de nombreux domaines4,5. Ces nanoporteurs biologiques peuvent être des médiateurs critiques de la communication intercellulaire6,7. Ainsi, des véhicules électriques spécifiques, des lipoprotéines et leurs cargaisons moléculaires sont également des biomarqueurs potentiels de la maladie8,9,10. Cependant, ces biomarqueurs ne sont souvent pas uniques aux cellules malades mais sont simplement surexprimés. Par conséquent, une quantification précise est nécessaire. En raison de leur taille et de leur hétérogénéité, l'isolement à haut rendement d'EV et de lipoprotéines spécifiques reste difficile et peut introduire un biais substantiel dans le dosage des biomarqueurs11,12,13,14,15. Les véhicules électriques et les lipoprotéines ont également tendance à se dégrader, à s'agréger ou à être adsorbés dans de nombreux dispositifs16,17. Ainsi, l'isolement immédiat et à court contact est préféré à la cytométrie en flux et à la séparation par chromatographie, dont les processus de prétraitement/séparation sont longs et complexes. Une méthode d'isolement efficace, rapide et accessible est donc une condition préalable à toute application clinique impliquant des véhicules électriques et des lipoprotéines. Les progrès des technologies de capture à haut rendement sont bénéfiques dans de nombreux espaces biomédicaux, y compris pour la détection de virus ou de bactéries pathogènes.

La méthode d'isolement de l'EV et des lipoprotéines la plus spécifique est l'immunocapture ;18,19,20 cependant, les technologies traditionnelles d'immunocapture, comme l'immunoprécipitation (IP) et la chromatographie d'immunoaffinité, ont des problèmes de faible rendement en raison de la saturation de la sonde et de la perte d'analyte. Si les nanoporteurs sont marqués par fluorescence, ceux capturés par les microbilles magnétiques peuvent être triés et quantifiés par cytométrie en flux. Cependant, le processus d'étiquetage et d'isolement prend du temps et peut nécessiter plus d'une journée pour atteindre le rendement optimal, ce qui entraîne une perte importante de nanoporteurs. Leurs débits sont également limités par la longue durée d'incubation (8 à 48 h) en raison de la faible mobilité des microbilles pour la réaction d'amarrage limitée par le transport. Une solution aux problèmes de rendement et de temps d'incubation consiste à utiliser des billes nanomagnétiques. Leur grande surface par volume fournit plus de sites de liaison. Leur plus petite taille conduit à une diffusivité plus élevée et à un temps d'incubation plus court (~ 30 min). Les billes peuvent également diffuser à travers un échantillon physiologique hétérogène pour capturer des cibles de nanoparticules spécifiques qui ont une mobilité réduite en raison de la complexification ou de l'agrégation. Leur grande surface par volume fournit plus de sondes de liaison d'un facteur égal au rapport des rayons microbilles/nanobilles (~100) pour la même concentration pondérale des billes. Cette augmentation du nombre de sondes peut conduire à l'épuisement complet de tous les nanoporteurs cibles, en particulier si les sondes d'anticorps ont une affinité élevée, fournissant ainsi des ordres de grandeur de rendement de liaison aux nanoporteurs plus élevés.

Cependant, en raison de leur nature superparamagnétique, il est difficile de piéger les nanobilles et leurs nanoporteurs capturés après immunocapture en masse. La force magnétique sur les billes superparamagnétiques est proportionnelle au gradient du champ au carré (deux fois le produit du champ et du gradient de champ), alors que la force sur une microbille magnétique est proportionnelle au champ local. Pour les pièges à microbilles magnétiques couramment utilisés, le gradient de champ est confiné à moins d'un rayon de la microbille et, par conséquent, ne peut piéger les nanobilles que dans une petite zone autour de la microbille. Par conséquent, une longue colonne de billes densément emballées est nécessaire pour une capture à haut rendement. Par exemple, les colonnes de microbilles commerciales (μColumn, Milyteni Biotec) pour la capture des nanobilles ne piègent que 20 à 30 % des nanobilles21. Un piégeage répété (> 4 ×) est nécessaire pour produire un rendement > 90 %. Un film magnétique peut produire une longueur de pénétration de champ plus élevée qu'une perle magnétique en raison de sa géométrie non focalisante (non radiale). Récemment, Issadore et ses collègues ont développé une membrane nanoporeuse recouverte d'une couche magnétique avec un rendement de capture amélioré, mais plusieurs couches de membranes sont encore nécessaires pour une capture efficace des billes22. Bien que le champ soit à longue portée, le gradient de champ n'est pas pour un film magnétique plan, sauf aux coins. Dans nos travaux antérieurs sur les champs électriques au niveau des microcanaux23 et des nanopores24, nous avons montré qu'un champ électrique singulier avec un gradient élevé se produit du côté à haute permittivité (eau) d'un coin de coin d'un canal ou d'un pore si l'angle de coin α de la phase de permittivité supérieure dépasse π. Ce champ singulier de coin se désintègre radialement à partir de la pointe du coin avec une échelle de loi de puissance de - (π / α) - 1 et a donc également un gradient de champ élevé. L'exposant de la décroissance radiale est lié entre -2 d'une sphère et -3/2 d'un cylindre infiniment long. Ce mode de coin singulier est antisymétrique autour du coin et introduit un dipôle dans la phase à haute permittivité. Il existe une singularité de coin « paratonnerre » plus connue dans la plasmonique en champ proche25,26,27 qui est symétrique autour du coin, le champ singulier se produisant du côté de la faible permittivité. Cela se produit lorsque le côté à haute permittivité a un angle de coin inférieur à π. Il introduit un monopôle sur le côté à faible permittivité du coin. Ici, nous étendons ce concept aux champs magnétiques pour obtenir une capture à haut rendement de billes superparamagnétiques à haut débit. Nous avons conçu un nanobord de NiFe superparamagnétique à plusieurs bords avec une jonction hétérogène, dont les bords soutiennent à la fois un monopôle magnétique et un dipôle autour de chaque nanopore d'une membrane polymère nanoporeuse. Cette approche augmentera considérablement le rendement de capture d'une membrane à 99 % à un débit de 5 mL/h pour une seule membrane nanoporeuse magnétique (MNM).

Par rapport au bord lisse des pores formé pendant la pulvérisation cathodique, les bords de la membrane électrodéposée sont plus nets pour se rapprocher de la géométrie du coin. Par conséquent, la galvanoplastie a été utilisée au lieu de la pulvérisation pour le dépôt de la couche de Ni80Fe20 (Fig. 1a). De plus, en raison du champ élevé à la jonction du film Au pendant la galvanoplastie, le film NiFe s'enroule autour de la couche d'or pulvérisée à l'intérieur du pore pour former la géométrie de bord souhaitée pour un dipôle. Les véhicules électriques non capturés peuvent traverser les pores droits et être collectés dans l'écoulement (Fig. 1b). Nous avons prouvé l'efficacité et la spécificité de MNM en utilisant des lipoprotéines de haute densité (HDL) comme modèle et avons observé que > 80 % des HDL sont récupérés à l'aide de la méthode, doublant presque le taux de récupération des kits commerciaux. Nous avons également démontré que le MNM a un rendement élevé et constant et, par conséquent, peut fournir les statistiques nécessaires pour quantifier les biomarqueurs portés par les véhicules électriques et les lipoprotéines dans des fluides physiologiques hétérogènes (Fig. 1c).

a Fabrication de la membrane nanoporeuse magnétique (MNM). Au total, 80 nm Au ont été déposés sur le film PET gravé pour fournir une bonne adhérence et une bonne conductivité électrique pour la galvanoplastie. Ensuite, un film de NiFe de 200 nm a été déposé sur la membrane par galvanoplastie. Au total, 10 nm Au ont finalement été déposés pour réduire l'adsorption non spécifique et l'instabilité chimique. À droite : la jonction nanoedge hétérogène au bord du nanopore sur la membrane est mise en évidence. b Configuration d'immunocapture basée sur MNM. Tout d'abord, l'anticorps et l'antigène ont été incubés pour former un complexe Ab-Ag, suivi d'une incubation avec des nanobilles magnétiques, qui ont été conjuguées avec des anticorps anti-IgG de lapin. Ensuite, l'échantillon dilué a été passé à travers la chambre du dispositif MNM avec une seringue et une pompe. Le dispositif MNM a été assemblé avec le MNM pris en sandwich entre deux puces imprimées en 3D. L'appareil était assemblé entre deux aimants, l'aimant près de l'entrée en forme d'anneau. Les billes magnétiques ont été capturées sur le bord des nanopores, comme souligné. c Étapes expérimentales des trois applications. Des anticorps anti-ApoA1 ont été utilisés pour capturer les HDL ; une membrane nanopore asymétrique a été utilisée pour isoler les véhicules électriques, avec une petite quantité de HDL restante, et nous avons utilisé MNM pour éliminer le HDL résiduel afin de purifier la fraction EV ; Dans la fraction EV, MNM a été utilisé pour capturer l'EV spécifique avec une protéine de surface particulière, c'est-à-dire l'EGFR.

Étant donné que le moment magnétique d'une nanobille superparamagnétique est induit par le champ externe, la force exercée sur celle-ci est décrite par :

où χeff est la susceptibilité magnétique effective des billes, V est le volume des billes, μ et μ0 sont la permittivité magnétique du vide et du matériau, et \(\vec{B}\) est le champ magnétique. La force magnétique augmente avec le gradient du champ au carré ou le double du champ multiplié par le gradient du champ. Ainsi, un gradient de champ magnétique élevé, et pas seulement un champ magnétique élevé, est la clé pour obtenir une récupération élevée des billes. De tels gradients élevés peuvent être introduits avec des géométries pointues (coins et cônes). Cette amélioration géométrique du champ électromagnétique a été appliquée à une variété de conceptions d'ingénierie, de l'antenne à grande échelle28,29 aux nanostructures30,31. Auparavant, nous utilisions le champ électrique singulier au bord des microcanaux23 et des nanopores24 pour piéger les colloïdes et transloquer les molécules par diélectrophorèse. Comme le montrent les figures 2a, c, le bord du nanopore sur la membrane pulvérisée est lisse. La couche NiFe ne couvrait que le dessus de la couche Au en raison de la nature anisotrope de la pulvérisation. Un bord plus net est apparu dans la membrane électroplaquée en raison de la focalisation du champ électrique pendant le placage (Fig. 2b, d). La différence géométrique peut également être observée depuis le haut des membranes (Fig. 2e, f). Une cristallisation plus fine de la membrane électrolytique (Fig. 2f) est observée, par rapport à la membrane pulvérisée (Fig. 2e), ce qui suggère qu'un coin plus net et un gradient de champ plus élevé peuvent être obtenus avec la membrane électrolytique. Le film NiFe s'est également développé à l'intérieur du pore pour former la jonction hétérogène en coin puisque, contrairement à la pulvérisation cathodique, la galvanoplastie se produit également sur le côté du film d'or à 80 nm. Sous aimantation externe uniforme à 0,4 Tesla, un champ maximal de 0,62 Tesla et un gradient maximal de densité de flux carré à 2,3 × 105 T2/cm se développent dans la phase aqueuse (Fig. 2h), contre 0,48 Tesla et 2,2 × 104 T2/cm pour le film NiFe pulvérisé sans l'anneau en coin, ce qui représente une multiplication par dix du champ de force de l'Eq. (1).

Schéma des nanopores sur (a) une membrane nanoporeuse magnétique pulvérisée, et (b) une membrane nanoporeuse magnétique électrodéposée, et le bord du nanopore est mis en évidence (la fine couche d'or finale est ignorée). c Images SEM en coupe d'un seul nanopore sur une membrane nanoporeuse magnétique pulvérisée. Notez le bord lisse de la couche NiFe (bleu). d Images SEM en coupe d'un seul nanopore sur une membrane nanoporeuse magnétique électrodéposée. Notez le bord tranchant de la couche NiFe (bleu). Images SEM de la membrane pulvérisée (e) et de la membrane électrolytique (f). g Simulation de la densité de flux magnétique (T) dans les nanopores sur une membrane nanoporeuse magnétique pulvérisée idéale (en haut) et des membranes nanoporeuses magnétiques électroplaquées idéales (en bas), montrant l'amplification spectaculaire de la densité de flux au coin sur le MNM électroplaqué (épaisseur de la membrane de gauche à droite : 200 nm, 150 nm, 100 nm). h Simulation du champ magnétique, montrant le gradient du carré de la norme de densité de flux (T2/cm) au coin sur les membranes nanoporeuses magnétiques pulvérisées idéales (en haut) et les membranes nanoporeuses magnétiques électroplaquées idéales (en bas) (épaisseur de la membrane de gauche à droite : 200 nm, 150 nm, 100 nm).

L'amélioration du champ élevé provient d'un monopôle de phase aqueuse au bord supérieur du film NiFe, où l'angle de coin sur la phase NiFe superparamagnétique à haute perméabilité est d'environ π/2, et d'un dipôle dans la phase NiFe au bord extérieur à la base de la jonction de coin, où l'angle de coin du côté NiFe est d'environ 3π/2. Il y a une amplification supplémentaire du champ dipolaire lors de son entrée dans la phase eau avec une perméabilité magnétique 40 fois plus faible. Dans la membrane pulvérisée, nous n'avons qu'un faible monopôle supérieur en raison du bord lisse (Fig. 2g). Cette combinaison du champ dipôle et monopôle aux arêtes vives du film de NiFe électrodéposé est responsable de l'augmentation de 10 × de la force de piégeage des nanobilles, et nous nous attendons à observer une augmentation similaire du rendement de capture pour les nanobilles superparamagnétiques.

Pour tester l'efficacité de capture du MNM avec le coin superparamagnétique à plusieurs bords autour de chaque nanopore, nous avons conçu un appareil de logement pour les applications d'immuno-capture MNM, qui est décrit dans la note complémentaire 3. Des membranes rondes de 2 cm de diamètre ont été testées au cours des expériences. En bref, 1 ml de nanobilles de 30 nm diluées 10 × du kit d'isolation Exosome Pan (souris, Miltenyi Biotec) ont été passés à travers la membrane nanoporeuse électrolytique de 450 nm (taille des pores PET) à 1 ml/h. Pour toutes les expériences, la quantité de nanobilles est inférieure au niveau de saturation du MNM. La figure 3b montre la solution de billes avant et après la capture magnétique sur la membrane ; la couleur brunâtre des billes disparaît entièrement dans la solution d'écoulement, indiquant une efficacité élevée de capture des billes. Les nanobilles convectées par des lignes de courant proches de la surface sont piégées par le monopôle près du bord supérieur du film NiFe, comme le montre la figure 3a. Les perles restantes sont convectées dans le centre du pore et sont piégées par la force magnétique à dipôle élevé à l'intérieur du pore (Fig. 3c). Le plasma de souris saines a été utilisé pour valider la capacité de capture EV du MNM (détails dans la note complémentaire 4). L'image SEM (Fig. 3d) montre un exosome de plasma de souris amarré à des nanobilles capturées près du nanopore.

une image SEM de billes magnétiques capturées près des bords des nanopores par le champ monopolaire. Le diamètre du pore a diminué jusqu'à environ 300 nm après le dépôt de différentes couches métalliques. b Solution de billes avant passage à travers la membrane nanoporeuse magnétique (à gauche) et après filtration à travers la membrane aimantée (à droite). La couleur jaune indique les billes concentrées. c L'image SEM agrandie montre des nanobilles capturées à l'intérieur d'un seul nanopore par le champ dipolaire de la jonction en coin. d Image SEM d'un exosome de plasma de souris capturé près du nanopore. e Efficacité de capture des billes des membranes pulvérisées et électroplaquées à différents débits et tailles de pores. Pour la membrane électrodéposée, la taille des pores d'origine de 450 nm et 1 μm et des débits de 1, 5 et 10 mL/h ont été testés. Pour la membrane pulvérisée, la taille des pores d'origine de 450 nm et le débit de 1 mL/h ont été testés (n = 3 expériences indépendantes). Les barres d'erreur indiquent les écarts-types (SD) pour chaque condition.

La taille des pores diminue de 450 à environ 350 nm après la galvanoplastie, ce qui est encore plus grand que la taille typique des petits EV (sEV) de 30 à 200 nm, permettant aux EV non cibles sans nanobilles de passer. Une étude quantitative de l'efficacité de la capture des billes a été menée en comparant la concentration des billes mesurée par analyse de suivi des nanoparticules (NTA) avant et après la capture (voir Fig. 3e). À 1 mL/h, > 99 % des billes ont été capturées. L'efficacité de capture des billes n'a pas diminué même à un débit de 5 mL/h. Ce débit est suffisamment élevé pour la plupart des applications d'immunocapture de vésicules extracellulaires. De plus, seulement 13 % des billes ont été perdues lorsque le débit a été augmenté à 10 mL/h. Pour les membranes avec une taille de pores de 1 μm, l'efficacité de capture des billes était toujours > 80 % à 1 mL/h. À l'opposé, seulement 22% des billes ont été capturées par la membrane pulvérisée à 450 nm (Fig. 3e). Pour les vésicules plus grandes au-dessus de 300 nm, le MNM électroplaqué avec une taille de pore de 1 μm peut être utilisé à un débit inférieur ou avec un champ magnétique externe plus élevé.

Sur la base de l'efficacité du MNM dans la capture des VE, nous avons cherché à étudier la capacité de cette méthode à capturer les lipoprotéines, à savoir les HDL (Fig. 4a). Les HDL sont très abondants dans le plasma et d'autres biofluides et fournissent un bon modèle à tracer basé sur des dosages de cholestérol standard qui peuvent être utilisés pour les quantifier. L'apolipoprotéine AI (apoA-I) est la principale protéine structure-fonction à la surface des particules HDL. L'ApoA-I est principalement associée aux HDL et représente environ 70 % de la teneur totale en protéines HDL en masse. Des échantillons de HDL ont été isolés à partir de plasma humain par ultracentrifugation à gradient de densité (DGUC) et les taux de protéines totales ont été quantifiés par des dosages colorimétriques32. Pour la capture, 2 μg d'anticorps anti-ApoA-I (Abcam, ab52945, lapin monoclonal contre ApoA1) ont été mélangés avec 100 μL d'échantillon HDL de 100 μg/mL, incubés pendant 30 min et traités avec 100 μL de nanobilles d'IgG anti-lapin (30 nm, Milyteni Biotec) pendant 1 h. Après que le HDL ait été immuno-capturé par les nanobilles magnétiques, la solution a été diluée à 500 μL avec 1 × PBS et passée à travers la membrane MNM électroplaquée à 450 nm, suivie d'un rinçage avec 1 mL 1 × PBS pour amener toutes les billes sur la surface de la membrane et pour éliminer la solution HDL résiduelle dans la chambre. L'écoulement a été recueilli pour chaque échantillon. Étant donné que le cholestérol n'est présent que dans les lipoprotéines et non dans les véhicules électriques, la concentration de cholestérol a été mesurée pour calculer la quantité totale de cholestérol dans l'échantillon d'origine et dans l'écoulement (Fig. 4b). Le taux de capture du cholestérol peut être calculé comme suit :

a Schéma de l'immunocapture du taux de capture des HDL en utilisant le cholestérol comme mesure. Dans les trois cas, différentes combinaisons ont été testées pour la capture spécifique des HDL avec des anticorps anti-ApoA1 et la capture non spécifique sans anticorps et les anticorps anti-ApoB, spécifiques des LDL. b Taux de capture des trois cas en (a) (n = 3 mesures dans chaque cas). c Comparaison du taux de capture de HDL à l'aide de différents kits d'immunocapture, notamment la colonne Miltenyi MACSTM μColumn et Thermofisher DynabeadsTM. Les schémas en médaillon montrent le principe de fonctionnement de base des différentes technologies. Le temps d'incubation a été choisi entre 1 h et 16 h pour les Dynabeads™ (n = 7 mesures pour chaque méthode). d Valeur Ct de miR-21 à partir d'expériences qRT-PCR. Les échantillons de miARN ont été extraits de HDL capturés à la fois par MNM et Dynabeads™ avec le même volume d'échantillon de départ (n = 3 mesures pour chaque échantillon). Le temps d'incubation de l'expérience MNM est de 1 h, et celui des Dynabeads™ est de 12 h. Les schémas de l'immunocapture et de la qRT-PCR ont été présentés dans l'encart. Le HDL a été capturé par MNM ou Dynabeads puis lysé, suivi d'une extraction de miARN et d'une qRT-PCR. Les barres d'erreur indiquent l'écart type (SD) dans chaque graphique.

Remarquablement, > 80 % des HDL ont été récupérés en utilisant cette approche. Pour confirmer la spécificité de l'immunocapture et de l'adsorption non spécifique dans notre dispositif, deux contrôles négatifs ont été testés. Si aucun anticorps n'était fonctionnalisé sur les nanobilles dans les expériences, moins de 10 % de HDL étaient perdus dans l'appareil, ce qui était dû à une adsorption non spécifique et à une erreur expérimentale. Lorsque des anticorps (Abcam, ab139401, monoclonal de lapin anti-ApoB) dirigés contre l'apolipoprotéine B, la protéine structurale des lipoprotéines de basse densité (LDL), ont été utilisés à la place de l'anti-ApoA-I, la perte a augmenté à 14 %. La perte supplémentaire de 4 % peut provenir de la capture non spécifique de HDL par l'anti-ApoB. Dans les deux témoins négatifs, le taux de capture non spécifique de <15 % est significativement inférieur au taux de capture spécifique de 80 %. Nous avons comparé notre méthode à un kit d'immunocapture commercial en utilisant leur protocole standard (voir la note complémentaire 5). Comme le montre la figure 4c, pour les nanobilles, seulement 20 % de HDL ont été capturés par la μColumn (Milyteni Biotec) en raison de la faible efficacité de capture des billes de la colonne garnie. De plus, pour des microbilles comme les Dynabeads™, même après 16 h d'incubation, ce qui est beaucoup plus long que le protocole standard, l'efficacité de capture des HDL ne dépasse pas 50 %. Pour le même temps d'incubation de 1 h que les nanobilles, seulement 25 % de HDL ont été récupérés (Fig. S4 supplémentaire), légèrement > 15 % de taux de capture non spécifique.

Pour démontrer davantage l'avantage de la méthode d'immunocapture MNM, l'extraction de miARN et la quantification qRT-PCR de miR-21 ont été réalisées sur des HDL capturées à la fois par MNM et Dynabeads™. La figure 4d montre une différence de Ct de plus de 6 entre les deux méthodes d'immunocapture, ce qui suggère que le résultat d'expression des miARN de Dynabeads™ est 64 fois inférieur à celui de MNM (méthode delta-delta Ct). Le long temps d'incubation requis par les microbilles provoque la dégradation de l'échantillon et la dégradation des miARN, ainsi que l'adsorption, ce qui entraîne un biais important dans la quantification des miARN. En revanche, une concentration élevée de miR-21 a été préservée dans l'immunocapture rapide de MNM.

Dans cette démonstration, 100 μL de plasma humain sain ont d'abord été dilués et traités par filtration à flux tangentiel avec des membranes nanoporeuses asymétriques de 30 nm pour éliminer la plupart des HDL et d'autres lipoprotéines (Fig. 5a). Comme le montre la figure 5b, il restait encore 17 % de cholestérol provenant principalement des LDL et des VLDL après filtration. Une petite quantité de HDL pourrait également être présente dans l'échantillon filtré en raison de la quantité dominante de HDL dans le plasma d'origine. Par conséquent, nous avons mélangé l'échantillon filtré avec 2 μg d'anticorps anti-ApoA-I et 2 μg d'anticorps anti-ApoB et l'avons incubé pendant 30 min. Ces apolipoprotéines sont spécifiques des lipoprotéines mais pas des VE. Après avoir ajouté 200 μL de microbilles d'IgG anti-lapin (30 nm, Milyteni Biotec) et incubé pendant 1 h, le mélange a été passé à travers le MNM. L'écoulement collecté était l'échantillon EV purifié, qui contenait 85% de l'EV d'origine de la caractérisation NTA de la figure 5c, mais seulement 5% du cholestérol d'origine. La distribution de taille de l'échantillon EV a également été préservée après purification, comme le montre la figure 5c, indiquant que MNM conserve non seulement 85% des EV en nombre, mais a également évité la lyse ou la coalescence des EV. Les résultats ELISA pour CD63 et CD9 sur la figure 5c ont également confirmé une perte minimale (13 à 17 %) avant et après la purification du MNM avec des procédures de retrait anti-ApoA-I et anti-ApoB.

a Schéma du fractionnement EV et de l'immunocapture de HDL. Le plasma dilué (échantillon I) traverse la membrane nanoporeuse asymétrique pour éliminer les autres particules avec un mécanisme d'exclusion de taille, obtenant ainsi la fraction EV (échantillon II). En raison de la quantité dominante de HDL, une petite partie de HDL est restée dans la fraction EV, elle a donc été incubée avec des anticorps anti-ApoA1 et anti-ApoB, puis des nanobilles magnétiques conjuguées à des anticorps anti-IgG de lapin et passées à travers le dispositif MNM pour éliminer le HDL, et le flux a été collecté (échantillon III). b Reste de lipoprotéines (cholestérol) à différents stades de purification des échantillons I, II, III en a), et (encart) EV concentration avant et après immunocapture MNM (échantillon II et III) (n = 5 mesures pour chaque échantillon). c Distribution de la taille des échantillons EV avec NTA avant (échantillon II) et après l'immunocapture MNM (échantillon III) montrant une perte minimale d'EV ou une lyse/coalescence. (encadré) Concentration de CD63 et CD9 avant et après immunocapture de MNM (échantillons II et III) mesurée par ELISA (n = 2 et 3 mesures pour CD63, CD9, respectivement). Les barres d'erreur indiquent l'écart type (SD) dans chaque graphique.

Une direction de recherche majeure dans le domaine des véhicules électriques consiste à identifier les véhicules électriques sécrétés par des cellules spécifiques (malades) ou par des voies spécifiques14. Dans cette étude, les véhicules électriques ont d'abord été isolés à partir de cellules cancéreuses colorectales humaines (DiFi) par une technologie de séparation ANM (membrane nanoporeuse asymétrique) basée sur la taille. Ensuite, des EV spécifiques avec des protéines membranaires EGFR de l'isolat ANM EV ont été isolés davantage par le MNM pour démontrer la quantification précise des miARN d'une sous-classe spécifique d'EV (Fig. 6a). Sur la base de l'analyse des véhicules électriques DiFi contenant de l'EGFR, les véhicules électriques isolés étaient probablement des exosomes basés sur la teneur en tétraspanine34. Certains des véhicules électriques libérés par les cellules DiFi présentaient un EGFR inactif et un EGFR34 actif. Nous avons utilisé un anticorps EGFR total qui capture à la fois l'EGFR actif et inactif dans cette expérience. Les surnageants de culture cellulaire DiFi ont d'abord été traités par filtration à flux tangentiel avec des membranes nanoporeuses asymétriques de 30 nm pour éliminer les protéines flottantes. En bref, 1 μg d'anticorps anti-EGFR ont été ajoutés à l'échantillon et incubés pendant 30 min. Après avoir ajouté 100 μL de microbilles anti-IgG humaines (30 nm, Milyteni Biotec) et incubé pendant 1 h, le mélange a été passé à travers le MNM. Des transferts Western de synténine-1 (en tant que protéine EV15, 35) et d'EGFR sont effectués à la fois sur la fraction isolée d'ANM et sur la fraction capturée de MNM pour valider la teneur en EV (Fig. 6e). Nous avons extrait les miARN de toutes les fractions au cours du processus et effectué une qRT-PCR pour évaluer les niveaux de miR-21. La figure 6b montre la teneur en miARN à l'intérieur des EV EGFR isolés, et le matériau d'écoulement s'ajoute également aux niveaux totaux de miR-21 dans l'échantillon d'origine avec une erreur de 21 %, ce qui est insignifiant étant donné que la qRT-PCR ne peut différencier que les changements doubles. La quantité totale d'EGFR dans l'isolat ANM et le débit MNM sont également mesurés par ELISA. Une chute de près de 90 % a été obtenue, ce qui indique que la plupart des EGFR ont été capturés dans l'isolat MNM EGFR (Fig. 6b, encadré). Les concentrations de CD63 et de CD9 à l'intérieur de l'isolat MNM EGFR sont proches de la moitié du total avant la capture de MNM (Fig. 6c), ce qui est cohérent avec le résultat miR-21 qRT-PCR (Fig. 6b). Pour explorer davantage le potentiel de quantification de notre système, nous avons effectué la même expérience sur des échantillons DiFi traités par ANM non dilués et 8 × dilués. Comme le montre la figure 6d, la variation de 8, 3 fois du niveau d'expression de miR-21 correspond au facteur de dilution, ce qui suggère que notre efficacité élevée est cohérente entre les différentes concentrations d'échantillons initiales, ce qui est important pour les études quantitatives de biomarqueurs.

a Schéma du fractionnement EV et de l'immunocapture d'EV avec EGFR. Le milieu de culture cellulaire DiFi a été passé à travers la membrane nanoporeuse asymétrique pour obtenir la fraction EV par séparation de taille (échantillon I), qui a ensuite été incubée avec les anticorps anti-EGFR puis des nanobilles magnétiques conjuguées avec des anticorps anti-IgG humaines. Ensuite, les échantillons sont passés à travers le dispositif MNM, avec l'échantillon capturé sur la membrane magnétique mélangé avec du tampon de lyse (échantillon II), et l'écoulement a été collecté (échantillon III). b Niveau d'expression de Hm-miR-21 de différentes fractions d'exosomes DiFi des échantillons I, II, III en (a) (n = 3 mesures pour chaque échantillon). (entrée) La quantité totale d'EGFR a été mesurée pour I et III, indiquant que la plupart des EV positifs à l'EGFR des EV isolés à l'ANM sont capturés par MNM (n = 7 mesures pour chaque échantillon). c Concentration en CD63 et CD9 de l'isolat ANM (échantillon I) et de l'isolat MNM EGFR (échantillon II) mesurée par ELISA. (n = 3 mesures pour chaque échantillon) d Niveau d'expression de Hm-miR-21 dans les exosomes EGFR avant et après dilution 8 × des échantillons DiFi et la valeur Ct de leurs résultats qRT-PCR (n = 5 mesures pour chaque échantillon). e Western blot des véhicules électriques isolés de la lignée cellulaire DiFi. Après le Marker Lane, puis (1) sEV isolé par ANM ; (2) Perle MNM capturée sEV. Chaque puits a été chargé avec 40 ug de protéine. Exposition Odyssey (en bas : 10 min, en haut : surexposée). Le panneau supérieur est transféré par EGFR et le bas par la synténine-1, respectivement. Les barres d'erreur indiquent l'écart type (SD) dans chaque graphique.

Ici, nous avons démontré l'utilité et l'efficacité du MNM électroplaqué avec des jonctions superparamagnétiques hétérogènes uniques. Cette méthode permet d'obtenir une capture à haut rendement de nanobilles superparamagnétiques. Nous avons obtenu une récupération de presque 100 % des nanobilles à partir de la solution jusqu'à 5 mL/h sur un seul appareil. Les véhicules électriques non capturés peuvent traverser les pores droits et être collectés dans le flux continu. Nous avons prouvé l'efficacité et la spécificité de notre dispositif en utilisant HDL comme modèle, avec > 80 % de particules HDL récupérées et une rétention non spécifique minimale à moins de 15 %. Le rendement élevé et constant de notre système offre un potentiel de quantification pour les études des véhicules électriques, des lipoprotéines et d'autres transporteurs d'ARN extracellulaires. Nous avons en outre démontré les performances de MNM dans la capture d'exosomes, la purification d'échantillons EV enrichis en HDL et la caractérisation des EV positifs pour l'EGFR. Le protocole de lyse directe dans cette étude est applicable à une variété d'analyses en aval pour la découverte et le diagnostic de biomarqueurs, telles que la qRT-PCR, la protéomique basée sur la SP, le séquençage, etc. Pour l'administration de médicaments, l'ingénierie tissulaire et d'autres applications nécessitant des véhicules électriques intacts comme porteurs, un protocole de libération de véhicules électriques est nécessaire. Les tampons de dissociation36,37, le lieur photo-clivable38 et les lieurs sensibles aux protéases39 sont des stratégies potentielles pour détacher les véhicules électriques du MNM. Notre plate-forme est également applicable à d'autres applications d'immunocapture moléculaire ou virale où l'efficacité et le débit de capture sont essentiels. En plus de l'isolement d'EV spécifiques du plasma pour les applications de biopsie liquide (dépistage des maladies et gestion de la thérapie), la technologie MNM devrait également être utile pour la découverte de biomarqueurs à partir de cultures cellulaires, comme nous l'avons démontré ici pour l'échantillon DiFi, ainsi que pour les modèles d'organes sur puce ou d'organoïdes35,40,41,42.

COMSOL a été utilisé pour modéliser et simuler différentes structures de nanopores afin d'estimer la densité de flux magnétique et son gradient. Un modèle de géométrie à symétrie axiale bidimensionnelle (2D) a été utilisé avec l'interface Champs magnétiques, pas de courant dans le module AC/DC. La courbe NiFe BH intégrée au logiciel a été utilisée. Une densité de flux magnétique statique de 0,5 T a été appliquée à la limite éloignée du modèle. La simulation a été réalisée avec un maillage contrôlé par la physique d'éléments extrêmement fins. Plus de détails ont été présentés dans la note complémentaire 1.

Les images SEM de surface ont été prises avec Magellan 400. Pour les membranes capturées par EV, une solution aqueuse de paraformaldéhyde de qualité EMS à 2% a été utilisée pour la fixation, et de l'or 2 nm a été pulvérisé à l'avance pour la conductivité. Les vésicules ont été examinées sous de faibles énergies de faisceau. Des coupes transversales des nanopores ont été préparées à l'aide du Helios G4 UX DualBeam (Thermo Scientific). Après avoir protégé la surface de la section transversale avec du Pt EBID, des tranches de 5 nm d'épaisseur ont été obtenues séquentiellement avec le logiciel Auto Slice & View™ 4 (AS&V4) fonctionnant avec un faisceau focalisé de 10 keV d'ions gallium. Le tranchage a été arrêté au centre du pore, et les images ont été acquises avec une tension de 3 kV à l'aide d'un détecteur TLD pour les électrons secondaires.

Les films PET gravés sur piste utilisés (PET115745, Wuwei Kejin Xinfa) ont une épaisseur de 11 µm et une densité de pores de 5 × 107/cm2. Pour fabriquer la membrane nanoporeuse magnétique électrodéposée, 80 nm Au ont été déposés sur les films PET gravés dans un évaporateur FC-1800. La couche d'or offre une bonne adhésivité entre le polymère et NiFe et fonctionne comme une couche germe pour la galvanoplastie. La membrane a été découpée en morceaux de 4 cm x 4 cm. Des rubans de cuivre ont été utilisés pour fixer les membranes sur le support et reliés électriquement à la cathode. Une plaque de nickel a été utilisée comme anode. La solution de galvanoplastie adaptée de la littérature43,44 se trouve dans la note complémentaire 6. Une densité de courant constante à 2 mA/cm2 a été appliquée par Keithley 2636A Dual-Channel System SourceMeter ; la tension est surveillée pendant le processus de galvanoplastie. Un réservoir d'agitation de galvanoplastie personnalisé a été conçu pour un dépôt uniforme. Le taux de dépôt a été dérivé d'images SEM sur des échantillons plus épais cultivés dans les mêmes conditions. Un autre Au de 10 nm a été déposé sur le dessus de la couche de NiFe pour réduire l'adsorption non spécifique et l'instabilité chimique. Des caractérisations supplémentaires des membranes sont détaillées dans la note complémentaire 2.

Identique aux échantillons électrolytiques, 80 nm Au a été initialement déposé sur les films PET. Les échantillons pulvérisés ont été préparés à température ambiante dans un système de pulvérisation UHV commercial Oerlikon DCSS utilisant une cible Ni80Fe20. Le débit de gaz Ar a été fixé à 20 sccm et la puissance du plasma était de 50 W pendant le dépôt. Le taux de dépôt a été dérivé au moyen d'un profilomètre à stylet et d'images SEM sur des échantillons plus épais cultivés dans les mêmes conditions. Après pulvérisation cathodique, 10 nm Au ont été déposés au sommet de la couche de NiFe.

Des échantillons de plasma anonymisés ont été obtenus auprès de Zen-Bio Inc. et consistaient en 10 ml de plasma humain frais prélevé dans des tubes avec un coagulant EDTA. Chaque échantillon a été testé pour les agents pathogènes comme l'exige la FDA. Tous les protocoles d'essai réalisés dans les études impliquant des participants humains étaient conformes aux normes éthiques de l'Université de Notre Dame.

Les cellules DiFi ont été cultivées dans un bioréacteur FiberCell C2011 avec des pores de 20 kDa en suivant les instructions du fabricant (FiberCell Systems, New Market, MD) en utilisant le milieu sans sérum défini des systèmes FiberCell (CDM-HD). Plus précisément, le bioréacteur a été lavé pendant une nuit avec du 1 × DPBS stérile (Corning, Corning, NY), puis pendant une nuit avec du DMEM à haute teneur en glucose (hgDMEM / Corning). Le bioréacteur a été traité avec 0,5 mg de fibronectine bovine (Sigma, St. Louis, MO) dans 20 ml de DMEM pendant 4 h à une nuit. Le bioréacteur a ensuite été lavé pendant une nuit avec du hgDMEM complet avec 10 % de sérum de croissance bovin (1 % de pénicilline-streptomycine [Pen/Strep, GIBCO, Dublin/Irlande], 1 % de glutamine [GIBCO], 1 % de glutamine [GIBCO], 1 % d'acides aminés non essentiels [GIBCO]). Le bioréacteur a été chargé avec 1 à 5 × 108 cellules DiFi dans du hgDMEM complet avec 10 % de sérum et laissé au repos pendant 1 h avant de faire circuler du DMEM complet avec 10 % de sérum. Les niveaux de glucose ont été surveillés quotidiennement avec un glucomètre (CESCO bioengineering, Trevose, PA), et lorsque les niveaux de glucose étaient à la moitié de ceux du milieu de départ, la bouteille de milieu a été remplacée. Lors des changements de milieu ultérieurs, le bioréacteur est passé de 10 % de sérum bovin à 5 % puis à 3 %, avant de passer à 10 % de milieu CDM-HD (DMEM-HD). Une fois que les cellules ont été établies dans du DMEM-HD (au moins 2 semaines dans du DMEM-HD), une récolte de routine de milieu conditionné a été effectuée, en retirant 20 ml de milieu conditionné par jour. Le milieu collecté a été centrifugé à 2000 tr/min pour éliminer les cellules et tous les gros débris, puis une sous-fraction du milieu a été en outre filtrée par gravité à travers un filtre seringue à pores Millex de 0,22 µm (Millipore Sigma, Burlington, MA). Au moins 3 jours de collectes de médias filtrés ont été regroupés.

Le plasma a été prélevé sur des participants humains consentants selon les protocoles et les directives actifs de Vanderbilt IRB. Le sang a été prélevé dans des tubes de collecte contenant de l'EDTA et immédiatement centrifugé pour séparer le plasma. Les HDL et LDL ont été isolées du plasma humain par ultracentrifugation à gradient de densité de KBr (DGUC), comme décrit précédemment32. En bref, les LDL natives (1,019–1,062 g/L) et les HDL (1,063–1,021 g/L) ont été isolées par DGUC séquentielle à l'aide d'une ultracentrifugeuse Optima XPN-80 avec des rotors SW41Ti ou SW32Ti (Beckman – Coulter). Les HDL et LDL ont été dialysées dans du PBS avec > 4 changements de tampon et concentrées avec des filtres de coupure mw de 3 000 Da (Millipore). Les taux de protéines totales ont été déterminés pour chaque échantillon de lipoprotéines (HDL et LDL) par des dosages colorimétriques BCA (Pierce, ThermoFisher).

Les nanobilles magnétiques sont achetées chez Miltenyi et utilisées telles quelles. Ces nanobilles mesurent 20 à 30 nm (vérifiées au SEM) et fonctionnalisées avec des anticorps. Exosome Isolation Kit Pan, souris (Cat#130-117-039), anti-lapin IgG MicroBeads (Cat#130-048-602) et Anti-IgG MicroBeads, human (Cat#130-047-501) sont utilisés respectivement pour chaque expérience.

Le kit de test de quantification du cholestérol (Sigma-Aldrich, CS0005) a été utilisé pour mesurer la concentration en cholestérol des échantillons. En bref, 44 μL de tampon de dosage, 2 μL de sonde, 2 μL de mélange d'enzymes, 2 μL de cholestérol estérase et 50 μL d'échantillon ont été mélangés et incubés à 37 °C pendant 30 min dans chaque puits. Une courbe d'étalonnage a été établie pour chaque mesure avec des échantillons standard contenant 0 à 5 μg de cholestérol. Tous les échantillons ont été dilués dans la plage de la courbe d'étalonnage avec le tampon de dosage. L'absorbance à 570 nm a été mesurée et comparée aux normes sur la même plaque pour déterminer le cholestérol total.

Les miARN ont été isolés à partir d'échantillons à l'aide du kit NucleoSpin® miRNA Plasma (Takara Bio) conformément au manuel du fabricant. 300 μL de l'échantillon ont d'abord été mélangés avec 90 μL de solution MLP et incubés à température ambiante pendant 3 min, suivis de l'ajout de 30 μL de tampon MPP et d'une incubation à température ambiante de 1 min. 3,5 μL (1,6 × 108 copies/μL) de cel-miR-39-3p dans de l'eau sans RNase ont été ajoutés au lysat en tant que contrôle enrichi de normalisation. Ensuite, le mélange a été centrifugé à 11 000 xg. Le surnageant a été prélevé et mélangé avec 400 µL d'isopropanol. Le mélange a été transféré dans la colonne de liaison et centrifugé à 11 000 × g pendant 30 s. La colonne a ensuite été lavée avec 100 μL MW1 et 700 μL MW2 séquentiellement à 11 000 × g pendant 30 s, suivi d'un lavage et d'un séchage de 250 μL MW2 à 11 000 × g pendant 3 min. Enfin, 30 μL d'eau sans RNase ont été ajoutés pour éluer le miARN à 11 000 × g pendant 1 min après incubation à température ambiante pendant 1 min. La transcription inverse a été réalisée à l'aide d'un kit miScript II RT (Qiagen). Une réaction de transcription inverse de 20 μL a été préparée avec 2,2 μL de miARN élué, 4 μL 5 × miScript HiSpec Buffer (Qiagen), 2 μL 10 × miScript Nucleics Mix (Qiagen), 9,8 μL d'eau sans RNase et 2 μL miScript Reverse Transcriptase Mix (Qiagen). La réaction a été incubée à 16°C pendant 60 min, puis à 95°C pendant 5 min. La réaction de transcription inverse a ensuite été diluée avec 200 μL d'eau sans RNase. Des triplicats de réactions qPCR ont été réalisés à l'aide du kit miScript SYBR Green PCR (Qiagen) et exécutés sur un système de PCR en temps réel StepOnePlus ™ (Applied Biosystems). La réaction contenait 2 μL d'ADNc dilué, 12,5 μL 2· QuantiTect® SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen), 2,5 μL 10· miScript Universal Primer (Qiagen), 10· miScript Primer Assay (Qiagen) pour le miARN cible et 5,5 μL d'eau sans RNase dans un volume final de 25 μL. Les mélanges réactionnels ont été incubés pendant 15 min à 95 ° C, suivis de 45 cycles de 94 ° C pendant 15 s, 55 ° C pendant 30 s et 70 ° C pendant 30 s. Les valeurs Ct ont été acquises et analysées à l'aide du logiciel StepOne™ v2.3 conformément aux directives MIQE45. Les valeurs Ct des miARN cibles ont été ajustées par un contrôle standard enrichi (cel-miR-39-3p) ajouté lors de l'extraction des miARN. Le niveau d'expression est calculé par la méthode delta–delta Ct.

Le kit ELISA EGFR humain (EGFR0, R&D Systems™), le kit ELISA CD63 humain (Cat#EH95RB, Invitrogen) et le kit ELISA CD9 humain (#MBS7607059, MyBioSource) ont été utilisés pour quantifier des protéines spécifiques dans les échantillons, respectivement, conformément aux instructions du fabricant. Les marqueurs EV CD9 et CD63 sélectionnés à partir des directives MISEV201846 ont été détectés dans des échantillons EV à des concentrations variables. Des courbes standards ont été établies pour chaque plaque, et les concentrations de protéines ont été déterminées par les lectures.

Les Western blots ont été réalisés selon le protocole général décrit précédemment47. En bref, les protéines ont été quantifiées par BCA (Thermo, Cat # 23235) en utilisant les instructions du fabricant. Quarante microgrammes de protéines ont été chargés dans chaque voie d'un gel de polyacrylamide-SDS à 11 % et soumis à une électrophorèse à 160 V pendant environ 5 h. Les protéines résolues ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose pendant une nuit à 4 ° C à 25 volts, puis bloquées avec un tampon de blocage Intercept (Li-COR, Cat # 927-60001) pendant 4 à 5 h. Les membranes de nitrocellulose ont été coupées en régions de poids moléculaire pour le transfert sur la base du poids moléculaire apparent tel que démarqué par les normes de taille (Bio-Rad, Cat # 1610374). Les anticorps EGFR (Millipore Rb, 1: 1000, Cat # 06-847) et Syntenin (Abcam, Rb, 1: 5000, Cat # Ab133267) ont été utilisés pour les immunoblots. La nitrocellulose a été coupée en haut, au milieu et en bas, respectivement pour ces marqueurs. Les transferts ont ensuite été sondés avec un IRDye 800 CW anti-lapin secondaire de chèvre (LI-COR, 1:5000, Cat # 926-32213). Les membranes ont été développées par Odyssey (Li-COR).

L'analyse de suivi des nanoparticules (NTA) a été réalisée à l'aide d'un NanoSight NS300 (NanoSight Ltd., Amesbury, Royaume-Uni) conformément aux directives MISEV201846. Tous les échantillons ont été dilués à la plage de particules de travail optimale avant les mesures à l'aide de 1 × PBS. Cinq vidéos de 60 s ont été enregistrées pour chaque échantillon avec le niveau de la caméra réglé sur 10. Un réglage de débit constant de 1000 a été maintenu pendant l'enregistrement. La température a été surveillée tout au long des mesures. L'instrument a été rincé avec 1 × PBS entre les mesures. Les vidéos enregistrées pour chaque échantillon ont été analysées avec le logiciel NTA pour déterminer la concentration et la distribution de taille des particules mesurées avec l'erreur standard correspondante. Le même seuil de détection a été utilisé pour l'analyse.

Le nombre de répétitions biologiques et les mesures effectuées sont précisés dans chaque figure. Les erreurs standard de tous les ensembles de données sont calculées et tracées à l'aide du logiciel OriginPro et revérifiées manuellement. Les données sont présentées sous forme de points de données individuels et moyenne ± SE.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données sources pour les graphiques et les diagrammes peuvent être trouvées dans les données supplémentaires associées à cet article. Des données supplémentaires qui ont contribué à cette étude sont présentes dans les informations supplémentaires. Les images de gel non recadrées et non éditées sont incluses dans la Fig. S7 supplémentaire. Toutes les autres données relatives à cet article peuvent être demandées aux auteurs correspondants.

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Les auteurs reconnaissent le soutien du Fonds commun des NIH par l'intermédiaire du Bureau de coordination stratégique/Bureau du directeur des NIH, 1UH3CA241684-01. CZ reconnaît le soutien d'une bourse du China Scholarship Council. Le RJC reconnaît le soutien de NCI R35 CA197570. Les auteurs reconnaissent le soutien de la subvention Cancer Cure Venture (CCV), rendue possible par la Walther Cancer Foundation.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Chenguang Zhang, Xiaoye Huo.

Département de génie chimique et biomoléculaire, Université de Notre Dame, Notre Dame, IN, 46556, États-Unis

Chenguang Zhang, Xiaoye Huo, Satyajyoti Senapati & Hsueh-Chia Chang

Département de biologie, Université de Notre Dame, Notre Dame, IN, 46556, États-Unis

Yini Zhu et Xin Lu

Département de médecine, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, 37232, États-Unis

James N. Higginbotham, Zheng Cao, Jeffrey L. Franklin, Kasey C. Vickers et Robert J. Coffey

Département de biologie cellulaire et du développement, École de médecine de l'Université Vanderbilt, Nashville, TN, 37232, États-Unis

Jeffrey L. Franklin et Robert J. Coffey

Aopia Biosciences, 31351 Medallion Dr, Hayward, Californie, 94544, États-Unis

Ceming Wang

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CZ, XH, CW et HCC ont conçu l'idée et conçu l'étude. CZ a effectué les simulations par éléments finis. CZ, XH, CW et ZC ont réalisé les expériences. CZ a analysé les résultats et rédigé le manuscrit avec les contributions de tous les auteurs. YZ, LX, JNH, JLF, KCV et RJC ont fourni des échantillons biologiques. CW, SS et HCC ont supervisé le projet.

Correspondance à Ceming Wang ou Hsueh-Chia Chang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Shi Hu, Yuanjin Zhao et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs principaux de la manipulation : Huan Bao et Gene Chong. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Zhang, C., Huo, X., Zhu, Y. et al. Membrane nanoporeuse magnétique électrodéposée pour l'immunocapture à haut rendement et à haut débit de vésicules extracellulaires et de lipoprotéines. Commun Biol 5, 1358 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04321-9

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Reçu : 12 mai 2022

Accepté : 30 novembre 2022

Publié: 10 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04321-9

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